Иммуноферментный анализ (ИФА). Применение ИФА

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:
высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
высокой специфичностью

возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала (от 1 мкл);
стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
простотой проведения анализа;
наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
возможностью автоматизации всех этапов реакции
относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях медицины, в том числе и при диагностике инфекционных, эндокринных, онкологических, иммунных и других заболеваниях

Специфическое взаимодействие между антигеном и антителом лежит в основе иммуноферментного анализа.
Антигены – вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций . Свойства антигенов определяются комплексом признаков: иммуногенность, антигенность, специфичность, чужеродность.

Иммуногенность – способность индуцировать иммунный ответ
Антигенность – способность антигенов избирательно реагировать со специфичными к нему антителами или антиген-распознающими рецепторами лимфоцитов. С понятием «антигенность» связан другой термин «чужеродность»: без чужеродности нет антигенности применительно к конкретному организму. Например, альбумины мыши не проявляют антигенные свойства по отношению к другим мышам, но являются антигенами для морской свинки.

Специфичность – структурные особенности, отличающие один антиген от другого. Способностью вызывать развитие иммунного ответа и определять его специфичность обладает фрагмент молекулы антигена – антигенная детерминанта (эпитоп), избирательно реагирующая с Аг-распознающими рецепторами и АТ. Эпитоп – наименьшая распознаваемая единица Аг; молекула Аг может иметь несколько эпитопов, т.е. быть поливалентной. Чем сложнее молекула Аг и чем больше у нее эпитопов, тем больше вероятность развития иммунного ответа.

Моноклональные АТ специфически распознают только одну Аг-детерминанту и связываются с ней. Поликлональные АТ распознают несколько антигенных детерминант в составе Аг. Количество молекул АТ, связывающих все эпитопы, определяет валентность Аг. Моноклональные антитела взаимодействуют только с одним эпитопом, таким образом, они проявляют абсолютную специфичность к определенному эпитопу. С использованием моноклональных антител резко повысилась специфичность иммуноферментной диагностики.

Иммуноглобулины сыворотки человека – это группа γ-глобулинов с идентичной базовой структурой, но отличающаяся по иммунологическим, биологическим и физическим свойствам. Синтезируются и секретируются они лимфоцитами В-линии. При антигенной стимуляции В-лимфоциты продуцируют в основном IgM. При пролиферации В-лимфоциты превращаются в плазматические клетки, которые секретируют в кровь высокоспецифичные антитела класса IgG, способные связывать дополнительное количество антигенов.

Иммуноглобулины представляют собой гликопротеины с молекулярной массой от 150 до 1000 кДа. В простейшем случае они состоят из 4 цепей: 2 одинаковых тяжелых цепей (Н, мол. масса 50 кДа) и 2 одинаковых легких цепей (L, мол. масса 25 кДа). Каждая цепь в свою очередь состоит из доменов (мол. масса 12,5 кДа), соединенных дисульфидными мостиками.

Все 4 цепи образуют симметричную Y-образную структуру. N-концевые участки H- и L-цепей представляют собой антигенсвязывающие фрагменты (Fab). Посредством гибкого участка – «шарнира» - они соединены с фрагментом Fc. Последний не участвует в связывании антигенов, но может реагировать с макрофагами, лимфоцитами и компонентами комплемента. N-концевой домен Fab-фрагмента является антигенспецифичным и называется вариабельным (V). С этой областью связана константная область (С), состоящая из одного домена и L-цепи (С1) и трех-четырех доменов Н-цепи (Сн1-4).
СL-домены могут относиться к типу к и λ, а СН-домены – к одному из 5 типов – γ, μ, α, ε или δ. Эти типы доменов различаются по аминокислотной последовательности и содержанию углеводов.

В зависимости от типа СН-домена иммуноглобулины относятся к одному из пяти классов IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE.
Таким образом, одна часть молекулы антитела (Fab-фрагмент) может связываться с антигеном, другая его часть (Fc-фрагмент) взаимодействует с различными элементами иммунной системы, например с фагоцитами или с одним из компонентов комплемента.
По свойствам антител различают два понятия – афинность (или аффинитет) и авидность (или авидитет). Афинность – это степень специфического средства активного центра к антигенной детерминанте. Авидность – это степень прочности связывания молекулы антитела с молекулой антигена. Чем выше аффинность (степень сродства), тем выраженнее и авидитет (прочность связывания). Основные характеристики иммуноглобулинов представлены в следующей таблице.

IgG – основной класс антител сыворотки. В составе молекул IgG сыворотки может быть большое количество поликлональных антител различной специфичности, но сходных по структуре. Антитела класса IgG продуцируются в ответ на проникновение в организм большинства бактерий и вирусов, способны агрегировать и покрывать небольшие растворимые белки, такие, как бактериальные токсины. Они участвуют в формировании активного иммунитета и иммунологической памяти. Антитела класса IgG активируют систему комплемента, связываются с антигенами на клеточной поверхности, представляя эти клетки для фагоцитоза (опсонизация). IgG, как самые мелкие иммуноглобулины, могут проникать через плацентарный барьер из крови матери в кровь плода.

Так как до рождения существенной продукции антител не происходит – для этого нужен контакт с чужеродным агентом, - IgG матери служат важным механизмом защиты новорожденного от инфекции.
Имеется 4 подкласса IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). При ряде заболеваний происходит перераспределение подклассов IgG, в частности, дефицит некоторых подклассов имеет значение в патогенезе возвратной инфекции, иммунодефицитных состояний, аутоиммунных заболеваний.

IgA составляют 10-15% иммуноглобулинов сыворотки, они могут представлять собой как мономеры, так и полимеры. Часть IgA в сыворотке – это полимеры, которые устойчивы к деструкции под действием патогенных бактерий. Вторая и, вероятно, наиболее важная форма IgA – это секреторные IgA. Они содержатся в продуктах внешней секреции (слезная жидкость, слюна, пот, слизь бронхиального и кишечного эпителия). Секреторные IgA – это первая линия защиты против бактериальных и вирусных антигенов. Секреторные IgA, продуцируемые В-клетками, внутри слизистого слоя селективно связываются с бактериями и предупреждают их адгезию к стенке.

IgM – самые крупные антитела. Они состоят из 5 одинаковых субъединиц, соединенных дисульфидными мостиками, каждая субъединица схожа с IgG. Это единственный класс антител, синтез которых начинается до рождения ребенка. IgM первыми появляются в сыворотке после введения антигена.
IgM способны нейтрализовать инородные частицы и, благодаря наличию множественных участков связывания, вызывают агглютинацию клеток.

Структура IgM человека: 5 доменов-10 мест связывания АГ.

IgE играют существенное значение в антипаразитарном иммунитете. Однако основное значение IgE имеют в развитии аллергических реакций, в том числе астмы, экземы и других аллергических заболеваний. Когда IgE встречается с соответствующим антигеном, клетка-носитель этого иммуноглобулина секретирует гистамин и другие вазоактивные вещества, вызывающие аллергическую реакцию.

IgD присутствуют в плазме в низких концентрациях, примерно 1% от всех иммуноглобулинов сыворотки. IgD – мономеры, по структуре схожи с IgG. О физиологической роли IgD известно мало.

Выбор стратегии тестирования, отбор приемлемых тестов или комбинации тестов зависит от трех критериев:
Целей тестирования;
Чувствительности и специфичности используемых тестов;
Распространенности инфекции в исследуемой популяции.

Выделяют 3 главные цели тестирования.
Скрининговые исследования. Скрининговые исследования проводятся, например, с целью обеспечения безопасности реципиента при переливании крови (пересадке органов), объектом их является здоровая популяция доноров. Скрининг крови и продуктов крови включает выявление маркеров гепатитов В и С, ВИЧ и сифилиса среди донорского контингента. Другим примером скрининга является обследование беременных на токсоплазмоз, краснуху, ЦМВ, герпес. К скрининговым можно отнести исследование на наличие маркеров гепатитов В и С, ВИЧ и сифилиса перед плановым оперативным вмешательством.

Эпидемиологические исследования. Специальные эпидемиологические или не связанные с ними анонимные тестирования с целью динамического слежения за частотой встречаемости и тенденцией распространения инфекции в данной популяции.
Диагностика инфекции. Добровольное тестирование сыворотки как пациентов без выраженных симптомов, так и лиц с клиническими признаками или симптомами, предположительно характерными для данной инфекции.

Чувствительность и специфичность – два главных фактора, которые определяют достоверность результатов теста при дифференцировке инфицированных и неинфицированных лиц.
Чувствительность теста определяется как доля лиц с положительным результатом, полученным при использовании данного теста в популяции с изучаемым заболеванием. Чувствительность является показателем частоты встречаемости ложноотрицательных результатов.

Специфичность теста – доля лиц с отрицательным результатом, полученным при использовании данного теста в популяции, где изучаемое заболевание отсутствует. Специфичность является показателем частоты встречаемости ложноположительных результатов.
Тест с высокой чувствительностью будет давать мало ложноотрицательных результатов. Тесты с высокой специфичностью будут давать мало ложноположительных результатов.

Распространенность инфекции
Вероятность того, что тест выявит инфицированность пациента по образцу сыворотки, значительно варьирует в зависимости от распространенности инфекции в популяции, из которой происходит пациент. Чем выше распространенность инфекции в данной популяции, тем выше вероятность того, что пациент, у которого результат анализа положительный, является действительно инфицированным (т.е. выше прогностическая ценность положительного результата – ПЦПР).

Таким образом, с увеличением распространенности инфекции число ложноположительных результатов снижается. Вероятность того, что пациент с отрицательным результатом тестирования является неинфицированным, т.е. прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР), также значительно снижается. Однако при увеличении распространенности инфекции увеличивается число ложноотрицательных результатов.

Промежуток времени с момента внедрения инфекционного агента в организм до момента появления антител в сыворотке крови называется серонегативным периодом. В связи с сопоставлением клинической эффективности разных методов в диагностике инфекций применение этого термина расширилось, и «серонегативный период в методе» часто определяют как период между проникновением инфекции в организм и выявлением маркера инфекции данным методом.
Период нарастания титра антител в ответ на первичную антигенную стимуляцию называется сероконверсией.

Определенные классы антител связаны с различными стадиями инфекционного процесса: первичная инфекция (острая), реинфекция, хроническая инфекция, реконвалесценция, перенесенная инфекция
Первичная (острая) инфекция может быть идентифицирована определением диагностически значимого уровня IgM в единственном образце или значимым ростом концентрации антител класса IgA и/или класса IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом в 1-4 недели.
Реинфекция выявляется быстрым подъемом уровня IgA и/или IgG-антител. IgA-антитела имеют более высокую концентрацию у пациентов старшего возраста и точнее диагностируют текущую инфекцию у взрослых.

Сероконверсия. IgM-, IgA- и IgG-антитела могут не выявляться в первичном образце и становятся позитивными во втором.
Реконвалесценция. Во время выздоровления существенно снижается уровень IgA- и/или IgG-антител; IgM-антитела отсутствуют.
Перенесенная инфекция. Отмечается присутствие IgG-антител без нарастания их концентрации в парных сыворотках, взятых с интервалом в 2 недели; IgM и IgA отсутствуют.

У новорожденных IgG в крови имеют, как правило, материнское происхождение. В то же время материнские IgM-антитела через плаценту не проникают, поэтому присутствие в крови новорожденных специфических IgM, образование которых у плода отмечается с 14-й недели развития, свидетельствует о врожденной инфекции.
IgM-антитела первыми синтезируются в ответ на первичную антигенную стимуляцию. Они определяются в сыворотке пациента с 5-го дня от начала заболевания и достигают пика в промежутке от 1 до 4 недель (в зависимости от этиологии инфекционного процесса). Затем их уровень снижается до диагностически не значимых концентраций независимо от эффективности проводимой терапии. Из-за раннего появления и короткого времени жизни определение IgM в сыворотке пациента может являться признаком острой стадии инфекции. Однако отсутствие этого класса антител еще не говорит об отсутствии инфекции, т.к. может иметь место хроническая форма заболевания.

IgG-антитела определяются через 15-20 дней от начала заболевания. Уровень специфических IgG повышается при иммунном ответе медленнее, чем IgМ, и продолжает увеличиваться после того, как содержание IgМ в сыворотке крови снижается. Часто этот период связывают со стадией перехода инфекции из острой фазы в хроническую. Обычно спустя несколько месяцев после выздоровления уровень IgG опускается ниже критического значения, тем не менее следует с осторожностью использовать данные анализа IgG в качестве показателя излеченности. Если организм справляется с инфекцией, то IgG могут еще длительное время оставаться повышенными. Таким образом, антитела IgG в сыворотке пациента могут свидетельствовать не только о текущей, но и о перенесенной инфекции

IgА в сыворотке пациента начинают определяться в период наибольшего титра IgМ или чуть позже, в зависимости от природы возбудителя (обычно через 10-14 дней от начала заболевания). В результате успешного лечения уровень IgА снижается к 2-4-му месяцу, а при реинфекциях вновь возрастает. Если уровень IgА не падает после проведения терапии, то это может указывать на хроническую или персистирующую форму инфекции. В течение короткого периода времени могут параллельно определяться IgМ- и IgА-антитела. В это же время или с небольшой задержкой могут быть определены антитела класса IgG. У пожилых пациентов для диагностики текущей инфекции предпочтительнее определять уровень IgА-антител, а не IgМ.

Таким образом, при постановке окончательного лабораторного диагноза инфекционного процесса с использованием серологических методов необходимо проводить определение IgA- и IgG-антител одновременно. При неясном результате IgA подтверждение осуществляется определением IgМ. Альтернативно второй серологический образец, полученный на 8-14 дней позже, должен быть проверен параллельно для определения роста концентрации IgG-антител.

Следует учитывать, что положительный результат анализа содержания IgG в сыворотке пациента в отсутствии других тестов может свидетельствовать как о текущей, так и о перенесенной инфекции, а отрицательный результат анализа содержания IgМ в сыворотке пациента без определения других тестов не может являться показателем отсутствия инфекции. Результаты тестов должны использоваться в совокупности с данными, полученными другими диагностическими методами, а также при амбулаторном осмотре больного с учетом данных анамнеза.