Криоконсервация, хранение и использовние стволовых клеток

Криоконсервация стволовых клеток
Криоконсервация – технологический процесс, включающий замораживание и последующее хранение тканей или клеток при сверхнизких температурах с сохранением их жизнеспособности после размораживания.

Для длительной криоконсервации клетки замораживают до температуры -80 °С или ниже. Необходимость использования сверхнизких температур связана с тем, что только при таких условиях в клетках практически полностью прекращаются все биохимические процессы. Так, при температуре 0°С время жизни клеток весьма ограничено.
Длительно сохранить клетки человека пока удается только в виде замороженной суспензии при температуре -80 °С или ниже. Сам процесс замораживания и последующего размораживания может оказать на клетку еще более губительное воздействие, чем просто охлаждение до 0 °С. Чтобы разрешить эту проблему, были изучены механизмы отрицательного влияния замораживания-размораживания и разработаны способы, позволяющие свести к минимуму повреждающие эффекты.

Концентрат стволовых клеток пуповинной крови перед криоконсервацией

В процессе замораживания клеток необходимо выделить следующие методические этапы:
1. Приготовление клеточных суспензий.
2. Подготовка клеточных суспензий к консервации (например, добавление криопротекторов).
3. Собственно замораживание.
4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях при определенных температурах.

Ёмкости для хранения стволовых клеток

Замерзание суспензии обычно начинается с кристаллизации внеклеточной воды только при понижении температуры до -10 °С, при которой и происходит формирование «очагов» кристаллизации воды. Замерзание внутриклеточной жидкости обычно начинается при температуре около -40°С. На этапах замораживания клеточных суспензий повреждение клеток могут вызвать следующие факторы:
1. Скорость замораживания.
2. Перегрев клеток при замораживании наблюдается в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Такой перегрев также может привести к необратимому повреждению клеток.
3. Холодовой шок.

Криопротекторы
Несмотря на перечисленные выше проблемы, удается заморозить и затем разморозить суспензии клеток, сохранив при этом их жизнеспособность. Этого можно добиться благодаря одновременному использованию двух подходов:
1. Применение криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать развитие криоповреждений и обеспечивать сохранность клеток в жизнеспособном состоянии после замораживания и размораживания.
2. Охлаждение с определенной, оптимальной для данного типа клеток скоростью.
Криопротекторы разделяют на быстро проникающие в клетку низкомолекулярные вещества (диметилсульфоксид), медленно проникающие (глицерин) и непроникающие высокомолекулярные вещества (полиэтиленоксид).
Общим механизмом действия криопротекторов является их способность связывать молекулы воды, что замедляет рост кристаллов льда.

Методы замораживания клеток и их хранение
Применяют два основных метода замораживания:
1. Неконтролируемое, или ручное замораживание, когда сосуд с суспензией клеток в смеси с криопротектором помещают в морозильную камеру (-80 °С) или в пары жидкого азота (-130°С) - замораживание происходит со скоростью примерно 1-3 °С в мин;
2. Контролируемое, или программное замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с помощью специальных приборов - программных замораживателей.
Такой способ позволяет достичь наилучших результатов. Замороженные клетки хранят в электрических морозильных камерах при температуре от -80 до -130 °С или в сосудах Дьюара: жидким азотом при температуре -196 °С. Чем ниже температура в хранилище, тем дольше можно сохранить жизнеспособные клетки.

Для заморозки стволовые клетки помещаются в специальный герметичный контейнер: криомешок или криопробирки.
Клетки из мешка можно использовать только один раз, в отличие от пробирок, которые можно размораживать по одной и использовать несколько раз.
Каждый образец стволовых клеток снабжают несколькими пробирками-спутниками из той же крови, чтобы при необходимости можно было провести дополнительные анализы, не размораживая основной образец.
Контейнер для заморозки
Криохранилище TYALOR-WHARTON с образцами стволовых клеток пуповинной крови

Размораживание клеток
Необходимо для восстановления функциональной активности клеток после хранения.
Существенным моментом является предотвращение токсического действия криопротекторов после размораживания (особенно токсичен для клеток диметилсульфоксид).
Размороженные клетки отмывают от криопротекторов in vitro путем постепенного добавления изотонического раствора, содержащего 10-20% сыворотки или альбумина, что смягчает эффекты изменения осмотического давления.

Использование стволовых клеток
Клетки могут быть использованы для лечения гематологических и онкологических больных (трансплантация стволовых клеток крови собственно больного или здорового донора при заболеваниях крови или солидных опухолях).
В гематологии, радиомедицине, иммунологии и других областях медицины: трансплантация клеток крови донора при приобретенных или врожденных апластических анемиях; острая и хроническая лучевая болезнь, врожденные иммунодефицитные состояния; рассеянный склероз; ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.

Только в одной Москве существует несколько государственных медицинских учреждений, использующих в лечении больных стволовые клетки.
Среди них можно выделить такие центры, как:
Россйский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина,
Медико-хирургический центр им. Н.В. Пирогова,
Гематологический научный центр,
Научный Центр сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН,
ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика Шумакова и другие.

Сахарный диабет
В настоящее время основным методом терапии диабета является инсулинотерапия, позволяющая поддерживать углеводный обмен больных в норме, или прием сахароснижающих препаратов.
При диабете 1-го типа поджелудочная железа не вырабатывает инсулин. Сегодня ученые с помощью клеточных технологий научились выращивать бета-клетки поджелудочной железы, ответственные за производство этого гормона. А это значит, что, используя стволовые клетки, можно восстановить его выработку поджелудочной железой и таким образом добиться полного излечения сахарного диабета 1-го типа.
При диабете 2-го типа инсулин вырабатывается, но ткани организма его не воспринимают. Благодаря стволовым клеткам можно нормализовать уровень сахара в крови больного, повлияв на иммунорезистентность тканей, что позволит отменить прием сахароснижающих препаратов.

Иммунотерапия в онкологии стволовыми клетками
Наиболее современной и действенной из них является клеточная терапия рака, а среди всех ее вариантов особое место занимает лечение стволовыми клетками. Онкология всегда возникает на фоне иммунодефицита – недостатка иммунных тел в организме, которые не способны обезвредить зарождающуюся злокачественную опухоль.
Виды рака, которые можно лечить стволовыми клетками
лейкемия;
лимфомы;
нейробластомы;
рак молочной железы;
рак яичка;
рак легких;
множественные миеломы (миеломная болезнь).

Аутизм
Аутизм - это расстройство, возникающее вследствие нарушения развития головного мозга и характеризующееся выраженным и всесторонним дефицитом социального взаимодействия и общения, ограниченными интересами и повторяющимися действиями, а также часто крайней неприязнью к определенным звукам, текстуре и вкусам.
Одним из способов лечения аутизма является применение стволовых клеток, извлеченных из человеческой пуповины (аллогенные мезенхимальные и CD34 клетки).

Детский церебральный паралич.
Стволовые клетки служат базовым материалом в строительстве тканей живого организма. На этом и построена методика лечения ДЦП стволовыми клетками. Вводя их в организм, врачи добиваются улучшения работы всех органов и систем, в частности нервной и мышечной.
При лечении церебрального паралича с помощью клеток важно начинать процедуры как можно раньше. В растущем организме гораздо больше шансов добиться успеха, чем в уже сформировавшемся.
Дети, по сравнению со сверстниками с аналогичным диагнозом, значительно быстрее развиваются, у них улучшается работа опорно-двигательного аппарата, речевого центра, головного мозга.