№3, посев

В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT- Mycobacteria Growth Indicator Tube, в дно которой встроен флуоресцентный кислородный датчик
1 раз в час флуоресцентный сенсор
считывает результаты тестирования
Технология MGIT
Положительные: очень яркое оранжевое свечение на дне пробирки и оранжевое отражение в колене пробирки
Отрицательные: незначительное или полное отсутствие свечения
(большое количество растворенного кислорода)

Технология MGIT
Отрицательная пробирка
Флуоресценции нет
Положительная пробирка
Сильная флуоресценция
Кислород потребляющие бактерии

Методика посева
Основные этапы:
Подготовительный этап: подготовка пробирок, стекол
Инокуляция образца, приготовление мазка
Загрузка пробирок MGIT в прибор BACTEC MGIT 960, культивирование посевов на плотных средах при температуре 37*С с еженедельным просмотром
Микроскопия осадка (с окраской флуорохромами или по Циль-Нильсену), выдача результата микроскопии
При положительном результате: микроскопия, пересев на кровяной агар, тесты на идентификацию (биохимические, ПЦР).
При отрицательном результате (если он вызывает сомнение, мутность пробирки, наличие зернистости на дне пробирки): микроскопия, пересев на кровяной агар
Выдача результата посева

Процедура посева
Необходимые реактивы и расходные материалы:
Пробирка BBL MGIT Tubes с модифицированной средой Миддлбрук и флуоресцентным детектором для культивирования микобактерий туберкулеза
Обогатительная добавка Supplement Kit
Пробирка с питательной средой Левенштейна-Йенсена
Пипетка Пастера одноразовая, стерильная 3,5-5 мл
Наконечники к автоматическим пипеткам: Т-200, Т-1000, Т-5000
Предметное стекло, облегченное
Контейнер для отходов;
Необходимое оборудование:
Ламинарный бокс II-класса защиты
Прибор BACTEC MGIT 960
Пипетки автоматические с переменным объемом до 200 мкл, до 1000 мкл, до 5000 мкл Таймер

Процедура посева
Подготовительный этап:
подготовка пробирок: отобрать необходимое количество пробирок MGIT, и пробирок со средой Левенштейна-Йенсена, промаркировать их;
Подготовка стекол: для приготовления мазка используются желательно новые, обезжиренные стекла, промаркировать стекла соответственно пробиркам.
Приготовить раствор антибиотиков PANTA: развести лиофилизированную PANTA в 15 mL OADC (Стабильность раствора- 24 ч при хранении в холодильнике)
В асептических условиях открыть крышку пробирки MGIT и добавить 0,8 мл раствора PANTA + OADC, используя автоматическую пипетку со стерильным наконечником

Процедура посева
Добавить 0.5 мл исследуемого образца в пробирку MGIT
0,2 – 0,3 мл образца
- засеять на плотную среду
0,1 мл образца, для
приготовления мазка
нанести на
предметное стекло

Закрыть пробирку крышкой и перемешать.
Загрузить пробирки MGIT в BACTEC MGIT 960.
Пробирки с плотными средами поместить в термостат в горизонтальных штативах не 2-4 дня, затем переставить в вертикальные штативы, еженедельно просматривать
Приготовленные мазки из осадка высушить, окрасить по Циль-Нильсену или флуорохом-ными красителями, промикроскопировать, оценить результат (согласно приказу МЗ РФ от 21.03.2003 № 109)
Процедура посева

BACTEC MGIT 960
Шаг 1: Выбрать меню.
Открыть одну из секций прибора
Выбрать на дисплее прибора
соответствующую иконку

BACTEC MGIT 960
Шаг 2: Считать штрих-кода пробирки с помощью сканера

BACTEC MGIT 960
Шаг 3: Поместить пробирку в указанную ячейку (горит
зеленый свет)

BACTEC MGIT 960
Микобактерии туберкулеза дают положительный рост не ранее чем на 4 сутки с момента посева
Если положительный рост наблюдается раньше - это может быть либо контаминация, либо рост нетуберкулезных микобактерий

BACTEC MGIT 960
Шаг 4: Извлечь позитивные и негативные (после
42 дня) пробирки, распечатать протокол исследования

BACTEC MGIT 960

Идентификация
Визуальный осмотр положительной пробирки (среда прозрачная, на дне пробирки зернистость или облако культуры)
Сроки роста (с 4-х суток)
Микроскопия по Циль-Нильтсену (корд-фактор)
Посев на кровяной агар, контроль контаминации (роста на кровяном агаре нет)
Биохимические тесты (ниациновый («+»), нитрат-редуктазный («+»), ПНБ-тест («-»), тест с салицилатом натрия («-»))
ДНК-идентификация (ПЦР, Hain-тест)

Бактериоскопия
BD предлагает широкий спектр красителей
Ziehl-Neesen 212520, 212511, 212517, 212516
Kinyoun stains 212522, 212523, 212518
Rapid 2-step modification of classical techniques (TB Quick Stain)
212315, 212316, 212317
TB Fluorescent Stain Kits 212519, 212521
AFB QC Slide (для 50 тестов) 231391

M. tuberculosis
мазок (окраска по Цилю-Нельсену)
Если в 1 мл мокроты- 10 000- 100 000 бакт.клеток
Чувствительность метода- 20% - 80%
Микроскопия следует за культивированием
(на жидких и плотных средах)

Быстрый и точный метод диагностики туберкулеза
BD ProbeTec ET

Пробирки MGIT (7 мл)
Пробирки BBL MGIT (100 пробирок) 245122
Пластиковые пробирки с полипропиленовой крышкой
7 мл модифицированной среды Middlebrook 7H9, pH 6.7
Флуоресцентный индикатор на силиконовой базе на дне пробирки

1. BBL MGIT OADC (6 x 15 мл) 245124
2. MGIT PANTA (6 бутылок)
лиофилизированная смесь антибиотиков разбавляется в 15 мл OADC
Polymyxin B G-палочки
Amphotericin B Грибы
Nalidixic acid G-
Trimethoprim Большинство аэробных бактерий
Azlocillin Ps. aeruginosa
Набор добавок

BD BACTEС MGIT 960
Дифференциальная диагностика
Идентификация МБТ-комплекса с применением теста на чувствительность p-NBA на приборе BACTEC MGIT 960.
Принцип метода:
Для дифференциации МБТ-комплекса от других микобактерий применяется чувствительность микроорганизма к пара-нитробензойной кислоте (p-NBA). Реагент ингибирует рост микобактерий, относящихся к МБТ-комплекса почти полностью, в том время как рост других микобактерий ингибируется слабо или не ингибируется совсем.
Тест м.б. модифицирован для применения с питательной средой BACTEC MGIT 960, в которой p-NBA будет ингибировать рост МБТ-комплекса, в результате чего будет снижаться потребление кислорода.
Этот процесс м.б. зарегистрирован прибором BACTEC MGIT 960 как низкий уровень роста (негативная пробирка).

Контроль контаминации
Контроль контаминации
Необходимо посеять жидкость из пробирки MGIT на чашки с кровяным агаром
Инкубировать в течение 24-х часов в термостате при +36 С
Наличие роста на чашке свидетельствует о КОНТАМИНАЦИИ материала.