Артериальная гипертензия

Антигены

Бактериальные антигены (АГ)
По специфичности:
1) группоспецифические
(встречаются у разных видов одного рода или семейства);
2) видоспецифические
(встречаются у представителей одного вида);
3) типоспецифические
(определяют серологические варианты – серовары – внутри одного вида).

Бактериальные антигены (АГ)
По локализации в бактериальной клетке:
1) О – АГ (соматический)
ЛПС (у грам-) или полисахарид (у грам+) клеточной стенки; термостабилен (выдерживает кипячение в течение 1–2 ч);
2) Н – АГ (жгутиковый) – белок флагеллин; термолабилен;
3) К – АГ (капсульный) – полисахарид (реже полипептид) капсулы;
по чувствительности к температуре К - АГ подразделяются на А-, В- и L-антигены.
Разновидности К - АГ: Vi – АГ, поверхностно-оболочечные АГ.
4) токсины и ферменты

Антитела (иммуноглобулины)

Структура молекулы иммуноглобулина

Реакция АГ-АТ в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов: агглютинации, преципитации, лизиса.
Для визуализации результата реакции также применяют различные метки, которые прикрепляют к АГ или АТ, а затем проводят детекцию меченного реагента:
флюорохромная метка для РИФ
ферментная метка для ИФА
радиоизотопная метка для РИА

Реакция агглютинации (РА) (от лат. agglutinatio - склеивание) – это склеивание корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, частиц с адсорбированными на них антигенами) антителами в присутствии электролитов.
Проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами.
Варианты РА:
прямая
пассивная (непрямая)

Реакция преципитации (РП) (от лат. praecipito - осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Варианты РП:
1) реакция кольцепреципитации
2) реакция преципитации в геле

Возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов происходит в соответствии с теорией решётки:
к образовавшемуся комплексу АГ-АТ последовательно присоединяются другие молекулы АТ и АГ, формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок.
Необходимое условие образования решетки - наличие несколько антигенных детерминант на каждую молекулу АГ и по два активных центра на каждую молекулу АТ (полные АТ).

Направления использования серологических реакций
Сероиндикация
это обнаружение АГ возбудителя в исследуемом материале с помощью известных АТ (диагностических сывороток);
реакции:
РПГА
РП
ИФА
РИФ
2. Сероидентификация
это определение АГ выделенной чистой культуры с помощью известных АТ (диагностических сывороток) (III этап бактериологического метода);
реакции:
РА
РП

3. Серодиагностика
это обнаружение АТ к возбудителю в сыворотке крови с помощью известных АГ (диагностикумов);
реакции:
РПГА
РА
РСК
нРИФ
ИФА

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА или РНГА) для сероиндикации
Ставится на стекле (пластинчатая РПГА)
Компоненты:
исследуемый материал (в нём ищут АГ)
диагностическая сыворотка – суспензионные АТ (антитела к искомому АГ, адсорбированные на эритроцитах I группы крови человека)
Учет визуальный:
при “+” реакции - красные хлопья, при “-” реакции – хлопьев нет

РПГА
Положительная
(красные хлопья)
Отрицательная
(нет хлопьев)

Реакция кольцепреципитации (РП) для сероиндикации
Реакцию ставят в узких преципитационных пробирках
Компоненты:
исследуемый материал (в нём ищут растворимый АГ)
преципитирующая сыворотка
Учет визуальный:
при “+” реакции на границе двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата; при “-” реакции кольца нет

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) для сероиндикации
Ставится на стекле
Компоненты:
исследуемый материал (в нём ищут АГ)
люминесцирующая сыворотка (- антитела к искомому АГ, меченные ФИТЦ)
Инкубация и отмывка несвязавшихся компонентов
Учет с помощью люминесцентного микроскопа:
при “+” реакции наблюдается специфическое (чаще – зелёное) свечение

ИФА для сероиндикации (“сэндвич” – вариант )
Ставят в лунках планшета
Компоненты:
1-ые АТ
исследуемый материал (в нём ищут АГ)
2-ые АТ, меченные ферментом (пероксидаза).
Инкубация, отмывка от несвязавшихся компонентов
Для учета в конце добавляют субстрат для фермента (Н2О2) и хромоген (ТМБ)
Учет:
или визуальный (изменение цвета раствора в лунке)
или с помощью спектрофотометра (измеряется оптическая плотность раствора в лунке)

Планшет для ИФА
Спектрофотометр (ридер)

Реакция агглютинации (РА) для сероидентификации
Ставится на стекле (пластинчатая РА)
Компоненты:
неидентифицированная чистая культура
диагностическая агглютинирующая сыворотка
Учет визуальный:
при “+” реакции – белые хлопья
при “-” реакции – равномерная мутность

Реакция преципитации в геле (РП) для сероидентификации
Ставится в чашках Петри с питательным агаром (выполняет роль геля)
Компоненты:
идентифицированная чистая культура
диагностическая антитоксическая сыворотка
Учет визуальный:
при “+” реакции видны белые “усы” (полосы) преципитации

Принципы серодиагностики
1. Определение количества (титра) АТ в сыворотке крови пациента
Титр АТ соответствует максимальному разведению сыворотки пациента, в котором реакция ещё положительная.
2. Титр АТ пациента сравнить с диагностическим титром
3. Изучение изменений титра АТ в динамике (в парных сыворотках с интервалом 7 – 14 – 21 дней)
4. Определение титра АТ разных классов: IgM, IgG, IgA

Реакция агглютинации (РА) для серодиагностики
Ставится в пробирках (развернутая РА)
Компоненты:
раститрованная сыворотка больного (в ней ищут АТ к определенному АГ)
бактериальный диагностикум
Учет визуальный:
при “+” реакции – белые хлопья
при “-” реакции – отсутствие хлопьев

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА или РНГА) для серодиагностики
Ставится в планшете (развернутая РПГА)
Компоненты:
раститрованная сыворотка больного (в ней ищут АТ к определенному АГ)
эритроцитарный диагностикум (АГ бактерий, адсорбированные на эритроцитах I группы крови человека)
Учет визуальный:
при “+” реакции – осадок в виде “зонтика”
при “-” реакции – осадок в виде “пуговки”

Реакция связывания комплемента (РСК) для серодиагностики
Ставится в пробирках
Компоненты:
сыворотка больного (в ней ищут АТ к определенному АГ)
диагностикум
комплемент
Для учета реакции добавляют индикаторную систему, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки.
Учет – визуальный:
при “+” реакции – осадок из эритроцитов
при “–” реакции – гемолиз (“лаковая кровь”)

Положительная РСК

Отрицательная РСК

ИФА для серодиагностики
Ставят в лунках планшета
Компоненты:
АГ бактерий (диагностикум)
сыворотка пациента (в ней ищут АТ)
антиглобулиновая сыворотка (АГС) (антитела к антителам), меченная ферментом
Инкубация, отмывка несвязавшихся компонентов
Для учета в конце реакции добавляют субстрат для фермента (Н2О2) и хромоген (ТМБ)
Учет:
или визуальный (изменение цвета раствора в лунке)
или с помощью спектрофотометра (измеряется оптическая плотность раствора в лунке)