Примеры методов разделения белков (фракционирования)

Хроматография – это физико-химический метод разделения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижной фазой обычно служит твердое вещество (сорбент) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

Разделение смеси белков
методом гель-фильтрации

Разделение смеси белков методом гель-фильтрации

Разделение смеси белков методом гель-фильтрации

Аффинная хроматография

Ультрацентрифугирование

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na).

В клетках в процессе синтеза полипептидных цепей, их транспорта через мембраны в соответствующие отделы клетки, в процессе фолдинга (процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру) и при сборке олигомерных белков, а также в период их функционирования в структуре белков возникают промежуточные, склонные к агрегации, нестабильные конформации. Гидрофобные радикалы, в нативной конформации обычно спрятанные внутри белковой молекулы, в нестабильной конформации оказываются на поверхности и стремятся к объединению с такими же плохо растворимыми в воде группами других белков. В клетках всех известных организмов обнаружены специальные белки, которые обеспечивают оптимальный фолдинг белков клетки, стабилизируют их нативную конформацию при функционировании и, что особенно важно, поддерживают структуру и функции внутриклеточных белков при нарушении гомеостаза. Эти белки получили название «шапероны» (Hsp70), что в переводе с французского обозначает «няня».

Процессинг белков.
Большинство белков синтезируется в виде предшественников, не обладающих нативной структурой. Процесс превращения белка-предшественника в структурно и функционально зрелый белок называется созреванием или процессингом. У разных белков процессинг протекает различно, однако можно выделить отдельные этапы процессинга:
Образование дисульфидных связей между боковыми радикалами остатков цистеина, стоящих на разных участках полипептидной цепи.
Расщепление одной или большего числа определенных пептидных связей и превращение полипептида-предшественника в конечный продукт 9ограниченный протполиз, прицельный протеолиз).
Присоединение простетических групп (углеводов, липидов, коферментов и др.), приводящее к образованию сложных белков и ферментов.
Химическая модификация боковых радикалов некоторых аминокислотных остатков в определенных белках (фосфорилирование, метилирование, гидроксилирование, карбоксилирование, йодирование и т.д.).
Ассоциация субъединиц как необходимый этап для белков, обладающих четвертичной структурой.

Биуретовый метод основан на образовании окрашенного в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет комплексного соединения ионов двухвалентной меди по месту пептидных связей белка в щелочной среде (биуретовая реакция). Для пептидной группы характерна лактам-лактимная таутомерия. В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди(II) с образованием стабильного окрашенного комплекса.

Фотометрический метод анализа основан на способности определяемого вещества поглощать электромагнитное излучение оптического диапазона. Концентрацию поглощающего вещества определяют, измеряя интенсивность поглощения. Поглощение при определенной длине волны является информацией о качественном и количественном составе определяемого вещества и составляет аналитический сигнал.

Спектрофотометрический метод анализа – основан на поглощении монохроматического излучения, т. е. излучения с одной длиной волны в видимой и УФ областях спектра.
Фотоколориметрический метод анализа – основан на поглощении полихроматического (немонохроматического) излучения, т. е. пучка лучей с близкими длинами волны в видимой области спектра. Фотоколориметрию используют в основном для анализа окрашенных растворов. Оба метода основаны на общем принципе – пропорциональной зависимости между светопоглощением и концентрацией определяемых веществ.

Основной закон колориметрии – закон Бугера–Ламберта–Бера записывается следующим образом:
где: D – оптическая плотность раствора, иногда обозначается буквой А;
I0 и I – интенсивность светового потока, попадающего на раствор (I0) и прошедшего через раствор (I);
ε – молярный коэффициент светопоглощения или экстинкции (величина, постоянная для данного окрашенного вещества), л/(моль•см);
C – концентрация окрашенного вещества в растворе, моль/л;
l– толщина поглощающего свет слоя раствора (длина оптического пути), см.

Если предмет отражает все цвета, то он виден как белый, а если никаких, то как черный. Если предмет имеет избирательное поглощение, т. е. лучи с различной длиной волны поглощает неодинаково, то он будет цветным, т. е. иметь хроматический цвет. Цвет непрозрачного предмета обусловливается лучами, которые он отражает, а прозрачного – лучами, которые он пропускает. Например, если прёдмет имеет зеленый цвет, то из пучка белого света он поглощает все лучи, кроме зеленых. Зеленые лучи, отраженные от предмета, попадают в наш глаз. Окрашенный раствор полностью пропускает лучи, обусловливающие его окраску, а также лучи, близкие по длине волны. Все другие лучи раствор поглощает, но не одинаково. Раствор поглощает преимущественно такие лучи, цвет которых является дополнительным к окраске раствора. Поэтому при пропускании через окрашенный раствор белого света, т. е. смеси лучей всех цветов, раствор поглотит только часть его, относительное поглощение света будет очень слабым и измерение неточным. Для получения большего относительного поглощения света и ставят такой светофильтр, который поглощал бы все лучи, кроме тех, которые преимущественно поглощает окрашенный раствор. Окраска такого светофильтра является дополнительной к окраске испытуемого раствора так, для красного раствора берут зеленый светофильтр, для синего – желтый и т.п.