Среды для культивирования эмбрионов-история разработки и составы

Среда определенного химического состава
(CDM - chemically defined medium):
может быть приготовлена по прописи в любой лаборатории
можно изменять содержание каждого компонента (оптимизация среды)
отсутствуют незапланированные биоактивные вещества (ферменты, гормоны, ростовые факторы и т.п.)
Пути разработки CDM
Эмпирический подбор компонентов для получения наибольшего успеха (максимальный % развития
in vitro):
Принцип “let the embryo choose ”
Подпор компонентов на основе изучения состава среды, в которой эмбрион развивается
in vivo:
Принцип “back-to-nature”

Эмбрионы мыши
1956: Whitten – культивирование эмбрионов мыши с 8-и клеток до бластоцисты (8 компонентов, растворенных в воде)
1957: Whitten – эмбрионы развиваются в культуре при замене хлорида кальция на лактат кальция (но развития с зиготы не получилось).
1958: Ann McLaren и John D Biggers культивировали на этой среде эмбрионы с 8-ми клеток, пересадили суррогатной матери и родились мышата
1963-66: Ralph Brinster, цикл работ - исследование изменения состава среды на развитие эмбрионов (воздействие источников энергии (содержание глюкозы и лактата); воздействие осмолярности среды, влияние газовой фазы (кислород).
Ralph Brinster 1967 – для развития эмбриона с зиготы необходимо присутствие в среде пирувата (сейчас все сред для развития эмбрионов млекопитающих
содержат пируват, в т.ч. и среды для культивирования эмбрионов млекопитающих.
John D Biggers - серия работ по улучшению состава, в т.ч. исследование влияния концентрации различных ионов на успех культивирования; использовал методы математического моделирования для оптимизации сред.
Создание сред для эмбрионов
Принцип “let the embryo choose ”

Ralph Brinster – в какой системе культивировать эмбрионы?
В настоящее время используются только вариант А – культивирование с микрокаплях под маслом и вариация варианта
С – культивирование в 4-х луночной плате
Принцип “let the embryo choose ”

“Response surface model”
геометрическое представление этой проблемы.
Проблема при разработке сред:
Как оценивать взаимодействие компонентов в среде при изменении их концентраций?
В данном случае представлена оценка совместного действия 2-х компонентов в зависимости от их концентраций в среде при помощи этой модели: 3-х мерная модель.
При изменении N компонентов среды – нужна n+1 - мерная модель
Принцип “let the embryo choose ”

Принцип “let the embryo choose ”
Блок развития при культивировании с зиготы: для решения проблемы были использованы математические программы и компьютерные модели
Sequential simplex optimization
SOM - simplex optimization method
Среда KSOM
Liwitts, Biggers:
“…. Two computer programs are now commercially available to control the experimental program—COPS from Elsevier Scientific Software, New York, USA, and SIMPLEX-V® from Statistical Programs, Houston, Texas, USA.
We have adapted the COPS program to optimize 10 components in a medium for the culture of mouse preimplantation embryos. Our method takes into consideration the biological variation associated with culture systems…. “

Sequential simplex optimization
Принцип “let the embryo choose ”
Simplex (noun) plural sim·plex·es
a spatial configuration of n dimensions determined by n + 1 points in a space of dimension equal to or greater than n

Простая среда – до 12 компонентов
Сложная среда – более 12 компонентов
Состав CD (chemically defined) сред для культивирования эмбрионов
Принцип “back to nature”

Сравнение состава среды HTF с опубликованными данными
о составе жидкости яйцеводов (по Biggers, 2001)
Принцип “back to nature” – подбор компонентов среды для культивирования эмбрионов in vitro, в соответствии с их концентрацией в естественном для эмбрионов окружении in vivo.
HTF human tubal fluid (Quinn et al., 1985).

Принцип “back to nature”

Источники энергии
пируват
лактат
глюкоза
Ооциты и зиготы способны усваивать только пируват !
Полная функциональность возвращается только на стадии 8-ми бластомеров!

Глюкоза: отрицательное воздействие на эмбрионы на стадиях дробления?

Гликолитический путь деградации глюкозы до пирувата:
Голубой цвет: участие в процессе АТФ и АДФ;
Желтый цвет: NAD и NADH;
Все промежуточные (между глюкозой и пируватом) компоненты фосфорилированы
Спор:
Bavister:
Глюкоза и фосфат
тормозят развитие дробящихся эмбрионов
Biggers:
Глюкоза не тормозит развитие эмбрионов (в концентрации, присутствующей в плазме крови – 5,56ммоль), фосфат оказывает
небольшое тормозящее действие.
Результат:
Специальные среды для эмбрионов на стадиях дробления (до 3 сут.) и для более поздних (3-5 сут.)

Biggers JD (2002), Reproductive BioMedicine Online
Осмотические свойства среды

Anal. Chem. 2008, 80, 6500–6507
Noninvasive Metabolic Profiling Using Microfluidics for Analysis of Single Preimplantation Embryos
John Paul Urbanski, Mark T. Johnson, David D. Craig, David L. Potter, David K. Gardner,|
and Todd Thorsen
Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge,
Massachusetts Fertility Laboratories of Colorado, Englewood, Colorado 80110

Metabolic profiles obtained from 10 murine embryos, labeled a-j. Results are from day 4 of the culture and are presented relative to original G2 media (analyzed in parallel with culture samples) to ascertain the changes in metabolite levels due to embryo activity.
Individual embryos were cultured in 1 μL of medium G2 for 48 h prior to analysis. Heterogeneity in metabolism becomes apparent among morphologically similar embryos.
Error bars indicate 1 standard deviation. The mean values for this population are represented by x, with dashed lines for visualization.
Anal. Chem. 2008, 80, 6500–6507
Анализ метаболической активности единичных эмбрионов