Бактериология: методы измерений и регистрации

До 1977 термины прокариоты и бактерии были тождественными
(молекулярная биология, 1977)
Прокариоты
Археи
Бактерии
количество прокариот на Земле оценивается в 5·1030
суммарная биомасса прокариот составляет 350—550 млрд т.
(масса человечества около 0.3 млрд. т.)
в кишечнике человека в норме обитает от 300 до 1000 видов бактерий общей массой до 1 кг

История изучения
в 1676 г. бактерии впервые увидел и описал голландский натуралист Антони ван Левенгук с помощью микроскопа с увеличением x250.
название «бактерии» ввёл в употребление в 1828 году Христиан Эренберг
В 1850-х годах Луи Пастер открыл их болезнетворные свойства. Изучал физиологию и метаболизм
Роберт Кох сформулированы общие принципы определения возбудителя болезни. В 1905 году - Нобелевская премия (туберкулез)
Детальное изучение строения бактериальной клетки началось с изобретением электронного микроскопа в 1930-е годы
Микроскоп Левенгука

Общая бактериология: морфология
Известно:
около 10000 видов
Предполагается , что общее
количество видов бактерий
на Земле более 1000000 !
Формы бактерий:
шаровидные
палочкообразные
нитевидные

Типичные размеры 0.5-5 мкм
Самая крупная Thiomargarita namibiensis - 750 мкм (0,75 мм)
Самая маленькая Mycoplasma mycoides - 0,1—0,25 мкм
Теория: сферическая клетка диаметром менее 0,15—0,20 мкм становится неспособной к самостоятельному воспроизведению
Размеры

Общая структура бактерий
Нуклеоид – ДНК, РНК, белки
(отсутствует мембрана, гистоны,
не делится митозом)
Цитоплазма –
а) рибосомы – синтез белка
б) плазмиды – генетические функции
в) включения – запас питательных
веществ
Цитоплазматическая мембрана –
транспорт питательных твеществ
Мезосомы – участие в деление
Клеточная стенка –
стабильность формы
Жгутики – перемещение бактерий

Стандартные методики детекции бактерий
Микроскопия
световая
электронная
флуоресцентная (окрашивание)

Оптическая
микроскопия
?
?
NA – числовая апертура

Световая микроскопия
Типы микроскопов
микроскоп прошедшего света
темнопольный микроскоп
фазовоконтрастный микроскоп
флуоресцентный микроскоп

“Нестандартные” методики детекции бактерий
Основаны на детектировании сигналов, строго специфических к различным штаммам бактерий
ПЦР (уникальные ДНК и РНК-последовательности)
Масс-спектрометрия (концентрация определенных жирных кислот)
Иммунологические методы (антигены к специфическим рецепторам, иммунофлуоресценция)
Конечные продукты метаболизма
Различные бионсенсоры

Стандартные методики детекции роста бактерий
Измерение оптической плотности раствора (суспензия)
Бак посевы (рост колоний на поверхности )
Стандартные методики определения чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП)
Метод серийных разведений
Диффузионный метод
(+) Простота, низкая стоимость
(-) Времязатратность.Эти методы требуют, чтобы прошло несколько циклов деления (анализ длится несколько дней)

Метод серийных разведений

Диффузионный метод определения
чувствительности к АБП

“Ускоренные” методики определения чувствительности к АБП
Исследуются чистые культуры, время анализа – несколько часов
выявлении изменений ферментативной активности бактерий;
Устойчивые к данному антибиотику микроорганизмы усваивают глюкозу,
что проявляется изменением кислотно-щелочного потенциала (pH) среды.
2) выявлении изменений окислительно-восстановительного
потенциала среды развивающимися микроорганизмами;
3) цитоморфологической оценке изменений бактериальных клеток
и формирования микроколоний;
4) определении изменений оптической плотности среды растущей
популяцией или включения радиоизотопов в микробные клетки;
5) использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами .
Для чего? В исследованиях Barenfanger показано, что сокращение среднего времени исследования от 44,4 до 39,2 ч. сопровождалось сокращением койко-дня с 12,6 до 10,7 суток, снижением средней стоимости лечения пациента с 6677 до 4927 долларов США и летальности – от 9,6% до 7,9%

Новые методы “быстрого” обнаружения бактерий
Ken Suslick, 2011 –
определение продуктов метаболизма бактерий по 36 маркерам,
детектирование “запаха” бактерий.
Тест длится несколько часов

Новые методы “быстрого” обнаружения бактерий
Universitat Rovira i Virgili, г. Tarragon(Испания), 2008 – ультрачувствительные аптосенсоры на основе углеродных нанотрубок на примере Salmonella typhi
Чувствительность –
несколько клеток в 1 мл
Время анализа –
несколько минут

Серология - раздел иммунологии,
изучающий взаимодействие антител сыворотки с антигенами.
Серология
«Серология» = «serum» (сыворотка) +«logos» (знание)
Серологические реакции:
1. Реакция преципитации.
2. Реакция агглютинации.
3. Реакция нейтрализации.
4. Реакция с участием комплемента.
5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Реакция преципитации.

Реакция агглютинации
Сила трения для шара в жидкости
Формула Стокса-Эйнштейна:
Чем больше размер тела,
тем быстрее оно оседает!

Реакция нейтрализации основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки или ткани. При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.
Реакция нейтрализации

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к комплексу антиген-антитело. Если комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая тем самым гемолиз эритроцитов
Реакция с участием комплемента

Реакция с использованием меченых антител или антигенов.
Иммунофлуоресцентный метод

Реакция с использованием меченых антител или антигенов.
Иммуноферментный анализ – ИФА (ELISA)

Принципы иммуноагглютинации
взгляд физика
Образование лиганд-рецепторных
комплексов
2. Образование агрегатов
Как правило, первая стадия
практически “мгновенна” по
сравнению со второй

Детектирование процесса иммуноагглютинации
Измерение продуктов реакции
На ансамбле:
турбидиметрия
нефелометрия
Одиночные частицы:
микроскопия
проточная цитометрия

Иммуноагглютинация: турбидиметрия
Источник
света
Фотоприемник

Биокинетика
Оптика
Прямая задача
Обратная задача

Уравнение Смолуховского
- агрегат, содержащий i мономеров
- константа скорости

Недостаток антигенов
Сравнимое количество
антител и антигенов
Избыток антигенов
Скорость агглютинации

Константа скорости k(1,1)

Фрактальная размерность агрегатов
Molina-Bolivar J.A. et. al. Fractal aggregates induced by antigen-antybody interaction //
2001 Langmuir v.17, p.2514-2520
Оптика: расчет уравнений Максвелла с помощью суперкомпьютеров

Биокинетика
Оптика
Прямая задача
Обратная задача