Иммуногистохимическая верификация нейродегенеративных изменений у мышей в двух моделях болезни

План презентации
Этиология и патогенез болезни Альцгеймера 3-6 с.
Цели и задачи 7 с.
Материалы и методы 8-11 с.
Результаты и обсуждение 12-17 с.
Выводы 18 с.

Болезнь Альцгеймера
Определение БА по классификации МКБ 10
Болезнь Альцгеймера (G30.+-) - это первичная дегенеративная болезнь головного мозга неизвестной этиологии с характерными нейропатологическими и нейрохимическими проявлениями. Болезнь обычно начинается незаметно и медленно, но неуклонно прогрессирует в течение нескольких лет.
Мозг здорового человека
Мозг человека при БА

Гиппокамп
Височные доли
Префронтальная
кора
Лобные доли
Теменные доли
Затылочные
доли
Мозжечок
Ствол
головного мозга
Прогрессирование нейродегенерации
при БА

Основные гипотезы возникновения БА
Холинергическая
Тау-гипотеза
Амилоидная

Модели Болезни Альцгеймера
Генетические
Фармакологические
Создание организмов с гиперэкспрессией генов APP, PS или тау-мутациями
Введение токсических веществ, (Аβ и/или тау-белка) в желудочки мозга, либо в гиппокамп
6
Alicia M. Hall and Erik D. Roberson, 2011
«Mouse Models of Alzheimer’s Disease»

Цель:
Провести сравнительное исследование двух способов введения Aβ25-35 в боковые желудочки мозга или интрагиппокампально на накопление Aβ и показатели нейровоспаления в мозге у мышей линии C57BL/6 методом иммуногистохимии (ИГХ).
Задачи:
Исследовать влияние введения Aβ25-35 в боковые желудочки мозга и гиппокамп на накопление Aβ во фронтальной коре и в CA1, CA3, зубчатой извилине гиппокампа мышей;
Исследовать влияние интравентрикулярного и интрагиппокампального введения Aβ25-35 на активацию микроглии во фронтальной коре и в CA1, CA3, зубчатой извилине гиппокампа мышей.

Материалы и методы
С57BL/6

Инъекции Aβ25-35
Координаты введения в желудочек: AP= -0,46 мм, ML= ±0,9 мм, DV= 2,5 мм.
Координаты введения в гиппокамп: AP= -2,06 мм, ML= ±1,3 мм, DV= 2 мм
LV
LV
DG
DG
LV – боковые желудочки
DG – зубчатая извилина

Пробоподготовка
Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents
Gregory J. Gage, Daryl R. Kipke, William Shain, 2012

Иммуногистохимия (ИГХ)

Результаты
Накопление Aβ в СА1 области гиппокампа мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: ***р<0,001 по сравнению с группой «Intact»; ###р<0,001 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Накопление Aβ в СА3 области гиппокампа мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: ***р<0,001 по сравнению с группой «Intact»; ###р<0,001 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Накопление Aβ в области зубчатой извилины мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с группой «Intact»; #р<0,05, ###р<0,001 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Накопление Aβ во фронтальной коре мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: ***р<0,001 по сравнению с группой «Intact»; ###р<0,001 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Активация микроглии в СА1 области гиппокампа мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: ***р<0,001 по сравнению с группой «Intact»; ##р<0,01, ###р<0,001 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Активация микроглии во фронтальной коре мозга мышей C57BL/6 при введении Aβ25-35 в боковые желудочки (LV) или интрагиппокампально (Hipp)
Оцифрованные данные (скорректированная на фон оптическая плотность) представлены как Mean±S.E.M. Статистически значимые различия: *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с группой «Intact»; ##р<0,01 по сравнению с соответствующей группой с введением растворителя (H2O).

Выводы
У мышей линии C57BL/6 выявлено сходное накопление Aβ в гиппокампе и фронтальной коре при билатеральном введении Aβ25-35 в боковые желудочки мозга и в гиппокамп в область зубчатой извилины;
Накопление Aβ во фронтальной коре и гиппокампе сопряжено с активацией микроглии и развитием нейровоспалительной реакции в этих областях мозга;
Накопление Aβ положительно коррелировало с активацией микроглии в СА1 области гиппокампа (rs=0,72, p<0,01) и во фронтальной коре (rs=0,8, p<0,001).

Личное участие
Выполненное исследование – это часть общей работы, в которой сравнивали поведение, морфологию и экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию синтеза и распада амилоида в мозге мышей с альцгеймероподобной патологией, обусловленной центральным введением Aβ25-35 в боковые желудочки мозга или интрагиппокампально, а также в которой исследовали терапевтическое действие активаторов аутофагии рапамицина и трегалозы на анимальной модели болезни Альцгеймера.
Мною было принято непосредственное участие в следующих этапах работы:
Проведение инъекций Aβ25-35 (анестезирование, фиксация животных с помощью стереотаксиса, инъекции стерильной воды и Aβ25-35);
Перфузия животных (вскрывание грудной полости, фиксация мозга, транскардиальной перфузией по протоколу Gage et al. 2012);
Забор биообразцов (декапитация и извлечение мозга, постфиксация в 4% р-ре параформальдегида в течение 12 часов при 4 при 4°C; инкубация в 30% сахарозе в течение 4 недель при 4°С, фиксация в среде для криотомии, замораживание в морозильной камере при –76°С);
ИГХ (использование непрямого иммуногистохимического метода: маркировка антигена первичными и вторичными антителами);
Микроскопирование, микрофотографирование и оцифровка данных в программе Image Pro Plus.