Получение и практическое использование антител

Структура антител
Классическая четвертичная структура антител
включает 4 полипептидные цепи:
две легкие L-цепи (от англ. Light — легкий)
и две тяжелые H-цепи (от англ. Heavy — тяжелый).
Тяжелые и легкие цепи формируют два антигенсвязывающих участка.
Связь цепей друг с другом осуществляется за счет многочисленных дисульфидных мостиков.
Третичная структура L-цепей образована двумя доменами, причем один из них является вариабельным (VL), а другой константным (СL).
Н-цепи образованы 4−5 доменами, причем один из них также является вариабельным (VН), а остальные — константными (СН1−СН4).

Характеристика основных классов Ig
Исследования аминокислотного состава СН областей тяжелых цепей у людей позволило выделить пять типов тяжелых цепей обозначенных γ, μ, α, δ и ε, , имеющих молекулярную массу от 50 000 до 70 000. Тип Н цепей определяет класс иммуноглобулина и его функциональные особенности. Выделяют 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgD и IgЕ.

Иммуноглобулин класса М. Наиболее круп­ная молекула из всех Ig.
Это пентамер, кото­рый имеет 10 антигенсвязывающих центров, т. е. его валентность равна 10. Тяжелые цепи молекулы IgM в отличие от других изотипов построены из 5 доменов. Период полураспада IgM — 5 дней.
На его долю приходится около 5—10 % всех сывороточных Ig. Среднее содержание IgM в сыворотке крови здорового взрослого человека составляет около 1 г/л. IgM филогенетически — наиболее древний иммуноглобулин.
IgM

IgG
Иммуноглобулин класса G. Изотип G состав­ляет основную массу Ig сыворотки крови. На его долю приходится 70—80 % всех сывороточ­ных Ig, при этом 50 % содержится в тканевой жидкости. Среднее содержание IgG в сыворот­ке крови здорового взрослого человека 12 г/л. Период полураспада IgG — 21 день.
IgG — мономер, имеет 2 антигенсвязывающих центра (валентность равна 2), Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Хорошо опре­деляется в сыворотке крови на пике первич­ного и при вторичном иммунном ответе.

IgA
Иммуноглобулин класса А. Существует в сы­вороточной и секреторной формах. Сывороточный IgA: На его долю прихо­дится около 10—15% всех сывороточных Ig. IgA — мономер, имеет 2 антигенсвязывающих. Различают подтипы А1 и А2. Хорошо опре­деляется в сыворотке крови на пике первич­ного и при вторичном иммунном ответе.
Секреторный IgA существует в полимерной форме в виде ди- или тримера (4- или 6-валентный) и содержит J- и S-пeптиды. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и их по­томками, плазматическими клетками со­ответствующей специализации только в пре­делах слизистых и выделяется в их секреты. Секреторная форма IgA — основной фак­тор специфического гуморального местного иммунитета слизистых оболочек

Mucosal Immunology (2011) 4, 590-597;
doi:10.1038/mi.2011.39
IgA

IgE
Иммуноглобулин класса Е (реагин). Содержание в сыворотке крови крайне невысоко — примерно 0,00025 г/л. Обнаружение требует применения специаль­ных методов диагнос­тики. На его долю приходится около 0,002 % всех циркулирующих Ig. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами и плазматическими клетками преиму­щественно в лимфоидной ткани бронхолегочного дерева и ЖКТ.
Не связывает комплемент. Не проходит че­рез плацентарный барьер. Обладает выражен­ной цитофильностью — тропностью к тучным клеткам и базофилам. Участвует в развитии гиперчувствительности немедленного типа — реакция I типа.

IgD
Иммуноглобулин класса D. Сведений об Ig данного изотипа не так много. Практически полностью содержится в сыворотке крови в концентрации около 0,03 г/л (около 0,2 % от общего числа циркулирующих Ig). Не связывает комплемент. Не проходит че­рез плацентарный барьер. Является рецепто­ром предшественников В-лимфоцитов.

При связывании специфического антигена В-лимфоциты взаимодействуют с Т-лимфоцитами-хелперами, пролиферируют/дифференцируются
в плазматические клетки, секретирующие антитела, и клетки памяти.
Антиген вызывает селекцию клонов В-лимфоцитов, экспрессирующих специфичные к нему BCR.
B-лимфоцит
Происходит от франц. humoral «гуморальный», далее из лат. humor (umor) «влажность, влага»

Практическое использование антител
Определение иммуноглобулинов разных классов в сыворотке и секретах позволяет оценить иммунный статус, выявить дефекты иммунной системы (общий уровень IgG,IgA,IgM)
Определение антител к конкретному возбудителю даёт возможность выявить причину инфекционного заболевания, определить его стадию, активность процесса и прогноз.
Препараты иммуноглобулинов используются:
для профилактики и лечения инфекционных заболеваний (противодифтерийная сыворотка, противостолбнячная сыворотка, противостафилококковый гаммаглобулин и др.)
для заместительной терапии при иммунодефицитных состояниях.

Препараты иммуноглобулинов человека назначается при следующих заболеваниях: иммунодефицитные состояния; аутоиммунные болезни; тяжелые вирусные, бактериальные, грибковые инфекции; профилактика заболеваний у лиц из группы риска (например, у детей, родившихся глубоко недоношенными).
Существуют также антитела против отдельных состояний. Например, антирезусный иммуноглобулин следует использовать при резус-конфликте во время беременности.
Пентаглобин производят из пула плазмы более 1000 доноров, в связи с чем он содержит спектр антител, свойственный нормальной популяции.

Каждое антитело распознает свой антиген и только его. А вот на каждый антиген может быть множество разных антител, которые распознают разные его участки (эпитопы). Разные антитела на один антиген называются поликлональными, то есть, состоящими из множества клонов — популяций антител.
А идентичные друг другу, одинаковые молекулы антител называют моноклональными . Поликлональные антитела куда дешевле и проще в производстве, чем моноклональные, но в иммунологических методиках чаще используют моноклональные, потому что они — абсолютно одинаковые молекулы, они гарантированно распознают один и тот же участок одного и того же антигена и потому гораздо стабильнее ведут себя в иммунологических методиках.

Как получить нужные, конкретные антитела
в большом количестве?

https://biomolecula.ru/articles/biotekhnologiia-antitel
https://biomolecula.ru/articles/kratkaia-istoriia-otkrytiia-i-primeneniia-antitel

Авторы гибридомной технологии-лауреаты Нобелевской премии
Технологию производства гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, разработали Сезар Мильштейн и Жорж Келер в 1970-х годах.
Технология получения гибридом не была запатентована, и метод беспрепятственно и быстро распространился по многим лабораториям мира, катализировав развитие иммунологической отрасли.
Позднее Мильштейн признался, что отсутствие патента было благословением, которое помогло ему плодотворно и свободно трудиться и делиться своими научными результатами. Как настоящий ученый, Мильштейн предпочитал не думать о том, что наличие патента сделало бы его миллионером. А в 1984 году труды Келера и Мильштейна отметили Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом»

Гибридо́ма — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и опухолевых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.
Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время.
Миеломная болезнь (от др.-греч. μυελός — костный мозг и -ωμα — окончание в названиях опухолей, от ὄγκωμα — опухоль), множественная миелома, генерализованная плазмоцитома — злокачественная опухоль из плазматических клеток . Заболевание системы крови, относящееся к лейкозам.

Антителопродуцирующие плазматические клетки
Антиген
Слияние клеток обоих типов
Клетки плазмацитомы
Получение очищенных моноклональных антител
Замораживание гибридом для сохранения
Размножение гибридом в мышах и производство антител
Размножение гибридом
Выделение нужных гибридомных клеток
Рост разных гибридомных клеток
Получение гибридом-
продуцентов моноклональных антител
Видео 1

Применение МКАТ (моноклональных антител).
Диагностика - приготовление тест- систем для диагностики инфекционных заболеваний, обнаружения опухолевых антигенов, диагностика лейкозов, определение групп крови, антигенов гистосовместимости (HLA) и др.
Фармацевтические задачи – получение лекарственных препаратов, содержащих Ат к опухолевым клеткам, различным бактериям и вирусам, к лимфоцитам, вызывающим отторжение трансплантата.
Вакцинология – с помощью МКАТ отбираются «нужные Аг», на основе которых готовятся вакцины.
Итак, гибридомная технология, базируясь на последних достижениях иммунологии, молекулярной биологии, вносит значительный вклад в решение актуальных задач как прикладной иммунологии, так и здравоохранения в целом.

Диагностика!

Иммунопреципитация
Иммунопреципитация — способ, с помощью которого можно выделить из смеси и осадить (precipitate) ту молекулу, которая нас интересует.

Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ИФА, по-английски ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay) используется для определения, присутствует ли в растворе искомый Белок Х, и если да, то в каких количествах. Этот метод, как и иммунопреципитация, похож на сказку «Репка», но цепочка «тянущих репку» немного длиннее. Схема ИФА показана на рисунке:

Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинг (англ. western blot) — еще один метод, в котором с помощью антител ученый может поймать нужный ему белок среди множества других. Последовательность этой «молекулярной рыбалки» очень похожа на ИФА, только «ловля» происходит не в лунке планшета, а на нитроцеллюлозной мембране (см. раздел «Ловушки для антител»). Схема вестерн-блоттинга показана на рисунке :

После внесения образца на подушку антигены (антитела) образца, в зависимости от назначения экспресс-теста, взаимодействуют с антителами (антигенами), конъюгированными с коллоидным золотом, нанесенными на подушку конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс антиген-антитело.
Иммунохроматография — очень остроумный метод обнаружения белка в анализируемой жидкости, в котором сам факт наличия жидкости используется для проведения реакции

Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с иммобилизованными на Тестовой линии антителами (антигенами). В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоска.
Не связавшиеся на тестируемой полосе антитела (антигены), мигрируют далее вдоль нитроцеллюлозной мембраны и неизбежно взаимодействуют с иммобилизованными на Контрольной линии антигенами (антителами). В результате появляется вторая окрашенная полоска. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.
ВИДЕО 2

ЭКСПРЕСС ТЕСТЫ
В основе каждого экспресс теста, который продается в аптеке, лежит метод иммунохроматографичческого анализа. Несмотря на столь сложное название, все происходит достаточно просто, и результат можно получить меньше чем через 15 минут. Тестовая полоска пропитана специальным реагентом, который реагирует на антитела в биологическом материале. Их вырабатывает иммунная система человека, если в организм попала бактерия, вирус или патогенные простейшие.
В качестве биологического материала для анализа используют:
Слюну.
Мочу.
Кровь.

ВИЧ/СПИД.
Гепатиты С и В.
Практически все заболевания, передающиеся половым путем (например, хламидиоз, сифилис, гонорея).
Туберкулез.
Язвенную болезнь и гастрит.
Некоторые раковые заболевания.

Иммуногистохимия
Многие антигены ученым и врачам хотелось бы определять не в сыворотке крови или в других жидкостях, а прямо на исследуемых тканях. Например, на опухолях. Ведь важно знать, экспрессируется ли на онкологической ткани тот или иной антиген: таким образом можно определить тип опухоли, предположить характер ее метастазирования и так далее. Способ, с помощью которого можно «увидеть» антигены на целой ткани, называется иммуногистохимией.

Проточная цитометрия
Основная идея проточной цитометрии — «поштучный» анализ клеток в потоке, проходящий с большой скоростью. Представьте себе суспензию клеток, которую необходимо изучить: это может быть кровь или ее фракции, отдельные популяции лимфоцитов или даже потенциально раковые клетки.
Основные принципы метода
Суть проточной цитометрии, пожалуй, можно изложить всего одним предложением: поток клеточной суспензии в ячейке сжимается, клетки выстраиваются в очередь и проходят через лазерный луч, регистрация рассеяния от которого позволяет охарактеризовать каждую клетку в потоке индивидуально.

МКАТ
В последние годы темпы развития рынка моноклональных антител непрерывно растут. В 2015 году глобальный доход от продаж таких препаратов составил чуть менее $90 млрд — это почти 60% от общего объема продаж всех биофармацевтических продуктов. При этом шесть из десяти самых продаваемых биофармацевтических продуктов в 2015 году оказались моноклональными антителами.
Humira, Remicade, Enbrel, Rituxan, Avastin и Herceptin являются шестью самыми продаваемыми препаратами на основе моноклональных антител

«ХУМИРА» (АДАЛИМУМАБ)
— это антитело, которое связывается с молекулой фактора некроза опухолей (TNF) и таким образом уменьшает воспаление. Препарат используют для лечения ревматоидного артрита, псориаза, болезни Крона и других аутоиммунных заболеваний. В 2015 году объемы продаж этого препарата составили $14 млрд, что сделало его самым продаваемым лекарством.
«Ремикейд» (инфликсимаб) и «Энбрель» (этанерцепт) — также препараты на основе антител, связывающихся с молекулой TNFα. Ввиду того, что эти препараты вышли на рынок несколько позже Humira, их объемы продаж несколько меньше: около $8 млрд каждого.

«АВАСТИН» (БЕВАЦИЗУМАБ)
— моноклональное антитело, блокирующее работу эндотелиального фактора роста A (VEGF-A). В 1989 году Наполеон Феррара, молекулярный биолог, работавший в лаборатории корпорации Genentech, обнаружил молекулу VEGF (Vascular endothelial growth factor) — белок, который способствует росту сети кровеносных сосудов (ангиогенезу). В 1993 году Феррара показал, что блокирование работы VEGF специфическими моноклональными антителами приводит к резкому замедлению роста различных опухолей.

Моноклональные антитела (top 5)

Ритуксимаб (Мабтера) - химерные (человек-мышь) моноклональные антитела к СD 20 рецептору
Мышиная вариабельная зона
связывается с CD20
на В-клетках
Человеческий каппа-содержащий
регион
Человеческий IgG1
Химерный IgG1
CD20- вовлечен в сигналинг через В-клеточный рецептор и участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки.

Препараты моноклональных антител

Возникает закономерный вопрос — почему рынок моноклональных антител столь популярен и быстро развивается?
Дело в том, что сейчас антитела — одни из самых удобных и эффективных инструментов для решения различных биомедицинских проблем. Антитела, как правило, хорошо переносятся организмом человека и обладают высокой специфичностью к антигену, что снижает риск неожиданных осложнений в клинических испытаниях. Зачастую для многих фармацевтических задач моноклональные антитела являются первыми кандидатами на получение продукта, который можно относительно быстро проверить в клинических испытаниях. Если предварительные исследования клинической эффективности успешны, то такой инновационный препарат можно быстро коммерциализировать и вывести на рынок.
https://biomolecula.ru/articles/kratkaia-istoriia-otkrytiia-i-primeneniia-antitel
https://biocad.ru/