Серологический метод исследования

Серологические или иммунологические реакции - это специфические реакции взаимодействия между антигеном (АГ) и антителом (АТ).
Серологический метод исследования

Серологические реакции
Всегда протекают в две фазы:
I фаза специфическая – характеризуется образованием специфического комплекса
АГ + АТ, видимых изменений нет.
II фаза неспецифическая – в эту фазу, образовавшийся комплекс АГ + АТ,
взаимодействует с неспецифическими
факторами среды (фагоцитами,
комплементом, электролитом),
при этом есть видимые изменения в виде склеивания клеток (проявляется осадок),
их растворения и др.
I II

Виды серологических реакций
Реакция агглютинации - РА
Реакция непрямой гемагглютинации – РНГА Реакция преципитации – РП
Реакция нейтрализации – РН
Реакция иммунного лизиса – РИЛ
Реакция связывания комплемента – РСК
Иммуноферментный анализ – ИФА
и другие.

Цель серологических реакций:
Выявление антител (АТ) 2. Определение вида
в сыворотке крови возбудителя (АГ) –
больного – это это называется
называется идентификация
серодиагностика возбудителя (АГ)

Реакция агглютинации (РА)
Это склеивание клеток (АГ) воздействием иммунных сывороток (АТ) в присутствии электролита.
РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из клеток (АГ) (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

Реакция агглютинации (РА)
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:
1) антиген - взвесь в изотоническом растворе (физ. растворе) убитой микробной культуры
2) антитело - сыворотка больного
3) электролит - изотонический раствор натрия
хлорида (физ. раствор)
1) АГ 2) АТ 3) электролит
в пробирке равномерная муть прозрачная прозрачная

Реакция агглютинации (РА)
Различают два метода постановки РА:
РА на стекле (ориентировочная)
Развернутая РА в пробирках

Реакция агглютинации (РА) на стекле
Пример:
Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят 3 капли:
1-ая капля: - сыворотка – контроль АТ (прозрачная)
2-ая капля: - сыворотка (прозрачная)
3-я капля: - изотонический раствор (электролит) - контроль АГ (прозрачная)
Добавляют во 2 и 3 каплю исследуемую чистую культуру бактерий (АГ), перемешивают, обе капли становятся равномерно мутными.
Результат оценивают по 2-ой капле через 3 – 5 минут.
Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината (в капле равномерная муть)

Если ориентировочная РА на стекле положительная проводится развернутая РА в пробирках.

Реакция агглютинации (РА)
РА применяют для
диагностики
брюшного тифа, паратифов,
бруцеллеза, а также для
определения групповой
принадлежности крови.

Реакция непрямой гемагглютинации – РНГА
Это склеивание эритроцитов с нагруженными на них микробными клетками (АГ)
воздействием иммунных сывороток (АТ) в присутствии электролита.
РНГА применяют при диагностики вирусных инфекций (например, гриппа, кори) для идентификации вирусов, а также для
выявления противовирусных антител
в сыворотке крови больных.

Реакция преципитации РП
Это осаждение клеток (АГ) воздействием иммунных сывороток (АТ) в присутствии электролита.
Различают два метода постановки РП:
Кольцепреципитация
РП в агаре
Компоненты как при РА:
1) антиген - взвесь в изотоническом растворе
убитой микробной культуры
2) антитело - сыворотка больного
3) электролит - изотонический раствор натрия
хлорида

Постановка реакции кольцепреципитация для обнаружения возбудителя сибирской язвы
Постановка:
1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ. растворе 5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта - АГ). Фильтруют.
2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку (АТ).
3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт - АГ).

В течение 10 мин. на границе между сывороткой (АТ) и экстрактом (АГ) в положительных случаях появляется мутное кольцо.
Учет реакции кольцепреципитация

Реакция преципитации в агаре
Постановка реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии).
Ставится на агаре в чашке Петри.
Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной
фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической
сывороткой.
2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски
бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные
культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур,
одна из которых, контрольная, должна быть
заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Анализ проводят через 24-48-72 ч.
Положительный результат (культура токсигенная)- на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, «стрелы-усики».
Учет реакции преципитации в агаре

Реакция преципитации РП
РП применяют для диагностики дифтерии, сибирской язвы, менингита, пневмонии, а также в судебной медицине – для определения видовой принадлежности крови.

Реакция нейтрализации
РН основана на способности АТ иммунной сыворотки нейтрализовать действие микробов и их токсинов на клетки. РН проводят путём введения смеси АГ – АТ животным.
Учет результатов: если животное выжило – реакция положительная, если погибло (нейтрализация не произошла) – отрицательная.
РН применяют для приготовлении антитоксических сывороток.

Реакция иммунного лизиса – РИЛ
Это способность иммунной сыворотки (АТ) лизировать (растворять) микробные клетки (АГ) в присутствии комплемента. В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки.

Реакция связывания комплемента – РСК
РСК основана на адсорбции (оседании) комплемента на комплексе АГ—АТ.
РСК применяют для диагностики инфекций, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.
В РСК участвуют две системы АГ – АТ.
Для проведения РСК необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Техника проведения РСК:
1 фаза (не различима глазом): соединяют смеси АГ (м/о) + АТ (иммунная сыворотка) +комплемент (сывороточная смесь от разных животных) + изотонический раствор.
2 фаза: смесь [АГ + АТ + комплемент] + АГ (эритроциты барана) + гемолитическая сыворотка (АТ к эритроцитам барана) + изотонический раствор.
Реакция связывания комплемента – РСК

Реакция связывания комплемента – РСК
Учёт результатов:
Если комплемент присоединился к комплексу АГ – АТ в 1 фазе, то гемолиза эритроцитов барана нет, реакция положительная – в пробирке муть
(комплекс АГ – АТ специфический).
Если в 1 фазе АГ не соответствует (не специфичен, не соединится) антителу, то и комплемент останется свободным. Свободный комплемент участвует во 2 фазе, вызывая гемолиз эритроцитов барана — результат отрицательный (в пробирках прозрачно — «лаковая кровь»).

Реакция Вассермана

Иммуноферментный анализ - ИФА
ИФА – метод выявления АГ с помощью АТ, конъюгированных ферментом – меткой (щелочная фосфатаза).
ИФА - современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:
1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);
3) исследование гормонального статуса пациента;
4) обследование на онкомаркеры;
5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.
Иммуноферментный анализ - ИФА