ПРОБЛЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ CpG-ОСТРОВОВ И ГОМОЛОГИЧНЫХ ИМ СТРУКТУР В РАЗНЫХ ГРУППАХ ОРГАНИЗМОВ.

CpG-islands in vertebrate genomes.
M.Gardiner-Garden, M.Frommer
(J.Mol.Biol.,1987, v.196. pp.261-282)
Observed/Expected ratio > 0.60
Percent C + Percent G > 50.00
Length > 200
Теперь эти параметры обычно ужесточают – но это не всегда правильно!
Обычно неметилированы или слабо метилированы
Отмечалось также наличие последовательностей GGGCGG, особенно в промоторной области гена и вниз по течению вдали от 5’конца. В промоторах это сайт связывания фактора Sp1 (единственный, связывающийся независимо от метилирования CpG-пары и способный разметилировать её).

Варианты расположения CpG-островов
Связанные с промотором и первым экзоном
Внутригенные, не захватывающие старт транскрипции
Захватывающие последний экзон и 3’UTR
Межгенные
Некоторые острова могут захватывать практически весь ген

Assessment of clusters of transcription factor binding sites in
relationship to human promoter, CpG islands and gene expression
(Katsuhiko Murakami, Toshio Kojima and Yoshiyuki Sakaki,
2004, BBC Genomics, 5:16)
Some CGI-related PWMs
Анализ коэффициентов корреляции показал, что выделяется группа факторов, скоррелированных с CpG-островами, а уже за счёт этого – с промотором.

Dualism of gene GC-content and CpG pattern in regards to expression in the human genome: magnitude versus breadth
A.E.Vinogradov
(Genome Analysis, 2005)
%GC для гена в целом связан с максимальным уровнем экспрессии в тканях
Наличие 5’-концевого острова и %CpG для гена в целом коррелирует с шириной спектра экспрессии в разных тканях. Первое подтверждено также в статье Loïc Ponger, Laurent Duret and Dominique Mouchiroud (см. далее).

Наличие 5’-острова коррелирует с шириной спектра экспрессии и для растений.
Gene-associated CpG Islands and the Expression Pattern of Genes
in Rice
Ikuo Ashikawa.
DNA Research, 2002, v.9, pp.131–134
Экспрессия в двух или более тканях или экспрессия в каллусе коррелирует с наличием 5’-концевого острова.

Comprehensive analysis of the base composition around the
transcription start site in Metazoa
Stein Aerts, Gert Thijs, Michal Dabrowski, Yves Moreau, Bart De
Moor (BMC Genomics 2004, 5:34)

Зачем нужны внутригенные острова?
Genes and Transposons Are Differentially
Methylated in Plants, but Not in Mammals
Pablo D. Rabinowicz, Lance E. Palmer, Bruce P. May, Michael T. Hemann,
Scott W. Lowe, W. Richard McCombie, and Robert A. Martienssen
Genome Research, 2003, v.13, pp.2658–2664
Внутренние экзоны генов млекопитающих обычно метилированы, в то время как внутренние экзоны генов высших растений – нет.

Distribution and Characterization of Regulatory
Elements in the Human Genome
(Jacek Majewski and Jurg Ott
2002, Genome Research, 12:1827-1836)
GGG- энхансер сплайсинга

Маевский и Отт – возможная роль CpG в сплайсинге, отсюда и падение в 3’-конце последнего экзона, который не сплайсируется.
Вообще в интронах CpG-острова мало представлены (см. презентацию Ю.Медведевой), но GGG-тринуклеотиды, характерные для CpG-островов – на самой границе интронов и экзонов.
%CpG для гена в целом в работе Виноградова, который коррелировал с шириной экспрессии, это, по существу, CpG внутригенных островов.

PEG3 (ZIM2)
Импринтируемый ген.
Обе изоформы – отцовские, но тканеспецифичность разная
PEG3 - 7 первых экзонов и 2 следующих за ними
ZIM2 – 7 первых экзонов и 4 (5), идущих после экзонов гена PEG3
Между экзонами генов PEG3 и ZIM2 – небольшой остров, частично метилированный. Влияет на сплайсинг, регулируя скорость транскрипции?

Determinants of CpG Islands: Expression in Early Embryo and Isochore Structure
Loïc Ponger, Laurent Duret and Dominique Mouchiroud
(Genome Res. 2001 11: 1854-1860)

MEST- импринтированный ген
Одна изоформа с отцовской экспрессией,
другая – с биаллельной
CpG-острова по всей видимости функциональны

CpG-острова в гене MEST (PEG1) у человека и мыши.
У человека начало фрагмента в 2 т.п.н. выше по течению от первого экзона, у мыши в 10 т.п.н. выше по течению от первого экзона.
Параметры поиска
Observed/Expected ratio > 0.70 Percent C + Percent G > 60.00 Length > 200
У человека оба острова находятся и при более жёстких параметрах
Observed/Expected ratio > 0.80
У мыши один из островов находится при тех же параметрах, другого не видно и при более мягких.

Выводы?
Ужесточение критериев поиска не всегда целесообразно даже для 5’-концевых островов, хотя и позволяет отбросить повторы. Искать не только по статистическим критериям, но, например, по консервативности и характерным мотивам?
Дополнительный старт – дополнительный CpG остров? В презентации Н.Опариной увидим, что так бывает, но сравнительно редко.

Структура CpG-островов и их флангов, связанных с альтернативными стартами,
в гене MEST (PEG1)
Скопления мотивов (локализовано программой А.Миронова).
CCWGG – фланкирует острова, метилируется
CTCF-консенсус – в неметилированном виде связывает CTCF
GGG – энхансер сплайсинга
YB-1-консенсус для YB-1-белка холодового шока. Это транскрипционный фактор, связывание которого блокируется CTCF. Связывается с экзонными энхансерами. Направляет альтернативный сплайсинг и выбор первого экзона. Входит в состав м-РНП, связывается с 5’-кэпом, влияет на трансляцию и время жизни РНК

Биологическая роль продуктов
локусов CDKN2a и CDKN2b

Гены CDKN2a и CDKN2b

р14 и р16 считываются с альтернативных стартов в разных рамках. CpG-острова, перекрывающиеся со стартом для р14, стартом для р16 и в экзоне – «хорошие» . Показано их связывание с МеСР2 при метилировании и независимое влияние метилирования каждого из них на транскрипцию соответствующего продукта в разных видах опухолей.
Тем не менее, и они выделяются только при использовании достаточно «мягкого» критерия. Соответствующие параметры, однако, совпадают для разных видов млекопитающих, у которых есть оба эти продукта.

Структура флангов CpG-острова, перекрывающегося с 1 α-экзоном гена CDKN2a
Наиболее интересен «старый» остров, перекрывающийся со стартом р16 (более «старым»)
CCWGG – фланкирует острова, метилируется
CTCF-консенсус – в неметилированном виде связывает CTCF
GGG – энхансер сплайсинга
YB-1-консенсус – связывает YB-1
5% альтернативно сплайсируемых генов имеют ARF. Гомологичны обычно у приматов, иногда в пределах млекопитающих. Позволяет исключить вопрос о функциональной значимости продукта. Хорошая модель для изучения альтернативных стартов?

Структура CpG-островов локуса р15-р16 у человека,
параметры поиска.
комплемент
Observed/Expected ratio > 0.60 Percent C + Percent G > 50.00
Length > 400
«старый» остров при Р16 находится лишь при наиболее «мягких» критериях
Length 540 (2457..2996)
Length 556 (4363..4918)
Length 666 (4921..5586)
Length 897 (8684..9580)
Length 469 (24036..24504)
Length 897 (28246..29142)
Length 470 (29283..29752)
Length 663 (29844..30506)
Length 497 (39417..39913)
Length 549 (40057..40605)
Length 1011 (42889..43899)

Структура CpG-островов локуса р15-р16 у быка,
параметры поиска.
Комплемент
Observed/Expected ratio > 0.60
Percent C + Percent G > 50.00
Length > 400
Length 420 (1017..1436)
Length 604 (1473..2076)
Length 446 (8133..8578)
Length 662 (10415..11076)
Length 747 (14064..14810)
Length 828 (32117..32944)
Length 500 (33026..33525)
Length 733 (33583..34315)
Length 773 (43552..44324)
Length 1027 (46366..47392)

Структура CpG-островов локуса р15-р16 у крысы,
параметры поиска.
Комплемент
Observed/Expected ratio > 0.60 Percent C + Percent G > 50.00
Length > 400
у крысы на месте CpG-острова для р16 сборка плохая (у мыши ещё хуже)
Length 707 (1624..2330)
Length 1010 (19932..20941)
Length 568 (32464..33031)
Length 683 (36115..36797

Тут опять ужесточение критериев поиска помешало бы увидеть биологически значимый, эволюционно более древний и консервативный CpG-остров, содержащий биологически значимые мотивы.
Обращает на себя внимание близость параметров, при которых обнаруживается аналогичная структура островов у разных млекопитающих.

Меланома у меченосцев
связана с геном CDKNX, дупликация которого дала р15 и р16. По функциям ближе к р16.

Провоцируется межлинейными и межвидовыми скрещиваниями

Характеристики CpG-островов гена CDKNX у Xiphophorus helleri
Вновь видим острова, перекрывающиеся со стартом р16 и с его экзоном. Они обнаруживаются при более жестких параметрах поиска.
(по работе S.Kazianis, L.Della Coletta, D.C.Morizot, D.A.Johnston, E.A.Osterndorff, R.S.Nairn,
2000, Carcinogenesis, v.21, n.4, pp.599-605)
Первый CpG-остров
Захватывает 5’-конец гена и первый экзон
CpG/GpC ratio = 0,98
Percent C + Percent G = 51,9%
Length = 538bp
33 CpG
Неметилирован в норме, слабо метилирован в меланомах
Второй CpG-остров
Расположен ниже по течению
CpG/GpC ratio = 0,99
Percent C + Percent G = 57,5%
Length = 317bp
26 CpG
Однако РНК, считанная с соответствующего гена, в меланомах экспрессируется избыточно

Особенности CpG-островов у рыб
Primordial stage?
Острова короче, а повышения содержания G+C нет, хотя есть повышение содержания CpG и внутри острова нет метилирования.
Это показано также, например, для MTF-1 гена Fugu.
5’UTR у рыб короче, а кодирующий район начинается непосредственно после старта транскрипции. Небольшая длина островов связана с этим? А может быть самые древние, ещё рыбьи острова – самые короткие?
MEST тоже есть у рыб – старт трансляции соответствует неимпринтированной изоформе, а соответствующий CpG-остров метилирован для обоих аллелей.

Возможна ли классификация островов по метилированности?
CpG Island Methylation in Human Lymphocytes
Is Highly Correlated with DNA Sequence,
Repeats, and Predicted DNA Structure
(Christoph Bock, Martina Paulsen, Sascha Tierling, Thomas Mikeska, Thomas Lengauer, Jorn Walter
PloS Genetics, 2006, v.2, i.3, e.26)
влияет также структура ДНК на флангах в 20 т.п.н.

Есть ли в других группах метилирование CpG и структуры, аналогичные CpG-островам?
Если есть метилирование, то должно быть и смещение частоты CpG (часть метилированных С мутирует в Т).

Относительные частоты динуклеотида CpG у разных организмов.
(Andrew J. Gentles and Samuel Karlin
2001 Genome Res 11: 540-546 .)

Метилирование у
Drosophila melanogaster
Есть высококонсервативная метилаза Dnmt2. Слабоактивна, метилирует в большей степени CpT и СрА, чем CpG (Dnmt3 млекопитающих тоже может метилировать CpT и СрА, хотя и предпочитает CpG). Мутанты жизнеспособны.
Есть метилсвязывающий белок МВD2/3. В большей степени связывает CpT и СрА, чем CpG, малоактивен. Мутанты жизнеспособны, нарушено расхождение хромосом. Может действовать как репрессор транскрипции. Может взаимодействовать с белками, участвующими в ремоделинге.
Есть метилированый С, но его доля 0,05-0,1% у взрослых мух (у млекопитающих 2-10%). Обычно в составе СрТ и СрА, но есть и СрG.
Показано наличие СрG-метилирования и его роль в регуляции активности гена Rbf (Ferres-Marco D., Gutierrez-Garsia I., Vallejo D., Bolivar J., Gutieres-Avino J., Dominguez M. Nature, 2006, v.439, pp.430-434)

Метилирование у других насекомых.
Метилаза комара Anopheles gambiae очень похожа на таковую у дрозофилы.
У молей Mamestra brassicae уровень метилирования CpG достигает такового у млекопитающих, но CpG-островов как скоплений CpG нет.
У тлей Myzus persicae наблюдаются скопления СрG. Однако для амплифицированного эстеразного гена тлей их метилирование коррелирует скорее с активацией гена.
У кокцид корреляция инактивации одного из хромосомных наборов (отцовского) с метилированием хромосом тоже скорее обратная.
(по работам F.Lyko и других авторов)

Comprehensive analysis of the base composition around the
transcription start site in Metazoa
У дрозофилы в регуляции транскрипции участвует целое семейство Sp-факторов. Их консенсус GC-богат

Особенности метилирования у растений.
Есть не только ферменты, которые метилируют CpG, но также метилирующие СрNpG и СрХ.
Не только CpG, но и СрNpG острова существуют как отдельные структуры.
Есть аналог геномного импринтинга у млекопитающих, хотя он связан скорее с разметилированием материнских аллелей.
Внутренние экзоны генов обычно неметилированы. Тем не менее, видим те же варианты расположения островов.
Малая длина островов: 0,2-1.0 kb vs 0,8-1,2 kb у млекопитающих (мы видели, что бывает и меньше). Остальные критерии сходны: наблюдается как повышение %GC, так и повышение O/E. Острова неметилированы.

Для выделения CpG-островов у растений необходим пересчёт параметров для типичного для них %GC и отношения CpG/GpC.
Важно использовать также критерий консерватизма выделяемых островов у разных видов.
В работе Ashikawa
это было сделано удачно. В цитируемой ниже работе из-за отсутствия подобного подхода получены лишь общие оценки.

По I.Ashikawa