Характеристические профили стероидных гормонов и аминокислот, полученные методами ВЭЖХ и ВЭТСХ

Краткая характеристика стероидов
Стероидные гормоны - биологически активные вещества, вырабатываемые железами внутренней секреции. Обладают строго избирательным
действием противовоспалительным и антиаллергическим

Заболевания, связанные с нарушением работы эндокринной системы
Причины заболеваний:
нарушения в биосинтезе
гиперпродуцирование гормонов
недостаточное продуцирование гормонов
Болезнь Иценко-Кушинга
(БИК)
Синдром Иценко-Кушинга
(СИК)
Первичный гиперальдостеронизм
(ПГА)

1) ИФА. Анализ содержания кортизола в сыворотке крови и моче
2) Дексаметазоновая проба
3) Данные ультразвукового исследования, КТ, МРТ
Традиционные методы диагностики

Структурные формулы кортикостероидов
и стероидных лекарственных средств
Эндогенные кортикостероиды
Преднизолон
Кортизон
ацетат
Дексаметазон
Кортинефф
Кортизол Кортизон
11-дегидро-
кортикостерон
11-дезоксикортикостерон 11-дезоксикортизол
Экзогенные стероидные лекарственные препараты
Кортикостерон

Цель работы
Оптимизировать хроматографические (ВЭТСХ и ВЭЖХ) условия разделения и пробоподготовки стероидных гормонов, провести хемометрическую обработку с целью получения дополнительных диагностических критериев
эндокринных патологий

Задачи
1. Оптимизация условий разделения стероидных гормонов с использованием методов ВЭТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.
2. Определить пределы обнаружения аналитов.
3. Разработка процедуры пробоподготовки.
4. Выявление возможности получения характеристических профилей.

Блок-схема
жидкостного
хроматографа

Высокоэффективная жидкостная хроматография стероидов
Хроматограмма смеси кортизола (F), кортизона (E), кортикостерона (В), 11-дегидро-кортикостерона (А), преднизолона (Pl), дексаметазона(DEX), кортизон ацетата (E-ac) и кортинеффа (Cort) (10 мкг/мл). Хроматограф HPP 4001 (Чехия), УФ-детектор (254нм), колонка «Supelco» 150*4,6 мм (3 мкм)
а)
15 мМ ДДСН
8 мМ β-ЦД
в)
Предел обнаружения 3 – 5 мкг/л

Комплексообразование циклодекстринов
(ЦД) со стероидными гормонами
β-ЦД:
Растворимость: 1,85 г/100 мл (25º ),
Объем полости: 0,346 нм³,
Внутренний диаметр полости: 0,60-0,65 нм,
рКа: 12,20

Хроматограмма смеси стандартов гидрофобных лекарств и эндогенных гормонов («Shimadzu»). Подвижная фаза: ацетонитрил-вода, градиентный режим. Детектор УФ, 254 нм. Скорость потока: 300 мкл/мин. Объем пробы: 20 мкл.
дексаметазон
преднизолон

ВЭТСХ
экспрессность
одновременное определение образцов
количественный анализ
Достоинства

Количественная обработка экспериментальных данных в ВЭТСХ методом видиоденситометрии с использованием программы Sorbfill TLC.
Количественная обработка данных (ТСХ)

Используемые материалы
Гидрофобные
соединения
Гидрофильные
соединения
С18
Purosep 270
(сверхсшитый
полистирол)
Силикагель
Фрагмент структуры сверхсшитого полистирола
Sуд=1500 м²/г,
плотность=0,7 г/см³
dпор =200Å

Схема твердофазной экстракции
Purosep 270
EtOH
СH2Cl2 MeOH/
2:1
0,1 н NaOH
20% CH3CN
40%EtOH
Твердофазная экстракция (ТФЭ)

Степень извлечения = (Sx-S)/ S0 * 100%,
где Sx – площадь хроматографического пика
аналита после экстракции объекта со стандартной добавкой;
S0 – площадь хроматографического пика аналита
до экстракции водного раствора стандарта;
S - площадь хроматографического пика аналита после
экстракции биологического объекта;
16

Метод главных компонент (МГК)
ti1ti2 – cчет образца
График счетов

График счетов
Виден четко сформированный кластер норм.
Имеется размытый кластер образцов с синдромом Иценко-Кушинга.

Альфа-аминокислоты, не поглощающиеся в УФ

Введение хромофорных групп - дериватизация
о–фталевый альдегид (ОФА)(II)
в присутствии тиольной компоненты 2-меркаптоэтанол; λвозб/λизл = 337/454 нм
4-фтор-7-нитробензо-1,2,3-оксадиазол (I), предел обнаружения 5 – 20 пмоль
диметиламиноазобензосульфонилхлорид (дабсилхлорид) (III)

Выводы
1. Оптимизированы условия разделения стероидных гормонов методом ВЭЖХ с УФ-детектированием с использованием в составе подвижной фазы β-циклодекстрина.
2. Определены пределы обнаружения аналитов.
3. Разработана процедура пробоподготовки мочи к хроматографическому анализу.
4. Выявлена возможность получения характеристических стероидных профилей для диагностики эндокринных патологий.
19

Спасибо за внимание!

Параметры удерживания в ВЭТСХ
где Zm – расстояние, пройденное веществом от стартовой линии до центра пятна (мм);
Zr – расстояние, пройденное элюентом от стартовой линии до фронта (мм).
Селективность
α=(КА/Кв)-1,
где КА, Кв – константы распределения аналитов между подвижной и неподвижной фазами.
Rf = Zm/Zr,
Эффективность
N = 16-(zi /w)2,
где w – ширина пятна, zf – путь, пройденный аналитом.

Дексаметазон
Преднизолон

Критерий гидрофобности стероидных гормонов
H = nH – 4√(nf),
где nH – суммарное число атомов
углерода и галогенов,
nf – число функциональных групп в
молекуле сорбата;

7

9
Хроматограмма

Анализ методом (ВЭТСХ)

Общая схема анализа биологических образцов методом ВЭТСХ
Концентрирование и очистка пробы
Анализ методом ВЭТСХ
Количественная обработка полученных данных методом видеоденситометрии

Аналит +
комплекс
комплексообразователь
Изменение селективности разделения и эффективности
Обнаружение аналитов, не поглощающих в УФ
Снижение пределов обнаружения