Иммунологические методы диагностики бактериальных инфекций: основные иммунологические реакции и их модификации

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция агглютинации позволяет выявить корпускулярные антигены и антигены, локализованные на поверхности сравнительно крупных частиц.
Агглютинат может быть двух типов – мелкозернистый и крупнохлопчатый.
Все реакции агглютинации подразделяются на два типа:
– ориентировочные , которые выполняются на стекле;
– развернутые выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
1. На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора.
2. Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно
распределить в капле физиологического раствора.
3. Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки.
4. Учесть результат реакции.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция Минкевича позволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента
Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют.
Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарного диагностикума(антигенный/антительный).

РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ПЕРЕКРЕСТНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Кастеллани: перекрестная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции и основана на правиле – специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела – и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ –только групповые.
Метод Нобля: основан на использовании концентрированных ингредиентов и применении механического фактора, ускоряющего агглютинацию, что позволяет получить результаты через 2-5 минут. Применяется для диагностики сыпного тифа

РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Реакции преципитации (РП) предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых, либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии антигена с антителом.
Метод имеет несколько разновидностей.
1. Реакция кольцепреципитации.
2. Реакция микропреципитации.
3. Реакция флокуляции.
4. Реакция преципитации в геле.
5. Реакция преципитации в агаре.
6. Иммуноэлектрофорез.

РЕАКЦИЯ КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ
Постановка реакции осуществляется в тонких пробирках и заключается в том, что вначале в пробирку вносится сыворотка, содержащая антитела к возбудителю сибирской язвы, на нее сверху осторожно наслаивается термопреципитиноген так, чтобы жидкости не перемешивались. При нахождении антигена в субстрате в месте соприкосновения двух жидкостей возникает кольцо преципитации (мутное кольцо).
Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).
Данная реакция выполняется для
скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОТОКСИНОВ
Применяется для идентификации бактериального экзотоксина по его видовой и типовой принадлежности, а также для определения наличия и силы антитоксина в исследуемой сыворотке, титра анатоксина.
Бактериальный экзотоксин в смеси с гомологичной сывороткой
(антисывороткой) не разрушается, а нейтрализуется.
Реакция флокуляции – это реакция преципитации в системе
токсин-антитоксическая сыворотка, характеризующаяся появлением хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке антигена

Реакции нейтрализации токсина антитоксином
Одной группе животных вводится только токсин, второй группе вначале вводится антитоксическая сыворотка, содержащая антитела к данному токсину, а затем и сам токсин. Если правильно подобрана антитоксическая сыворотка, то животное остается живым, а контрольное животное от действия токсина погибает
Реакция Дика. С целью определения уровня антитоксического иммунитета к скарлатине у здорового человека выполняют кожную пробу с очищенным токсином – эритрогенином. Реакцию учитывают через 24 часа после введения
Реакция Шика – реакция нейтрализации дифтерийного токсина антитоксинами организма. Она ставится для оценки напряженности иммунитета к дифтерии. Пробу выполняют со стабилизированным,очищенным дифтерийным токсином.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ, ГЕЛЕ
АГАР
Данный вариант реакции преципитации применяется для обнаружения токсина, вырабатываемого возбудителем при росте на агаре.
При росте культуры токсин пропитывает агар, одновременно из фильтровальной бумаги противотоксические антитела диффундируют в агар, и на месте их соединения образуется комплекс АГ-АТ,что становится видимым, как «усы» преципитации.
ГЕЛЬ
Принцип метода: вещества, диффундирующие
в геле навстречу друг другу, реагируя между собой, образуют преципитат беловатого цвета разной конфигурации. В контроле он не наблюдается.
Концевое слияние полос свидетельствует о полной идентичности антигенов; при стыке полос – неполное родство; перекрест – разные антигены, но есть групповые антигены

РЕАКЦИИ, ПРОТЕКАЮЩИЕ С УЧАСТИЕМ КОМПЛЕМЕНТА.
Реакция бактериолиза применяется редко, она используется для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других холероподобных бактерий. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису бактерий.
В реакции гемолиза АГ служат эритроциты, АТ – антигемолитические антитела. При образовании комплекса АГ-АТ начинается активация комплемента, в результате чего мутная взвесь эритроцитов превращается в
ярко-красную прозрачную жидкость . При постановке
диагностической реакции связывания комплемента (РСК)
реакция гемолиза используется как индикаторная.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Реакция Вассермана для диагностики сифилиса

РЕАКЦИЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ТРЕПОНЕМ
Реакция основана на наблюдениях Д.К. Заболотного (1907) и П.П. Маслаковца в отношении потери подвижности бледной спирохеты при добавлении к ее культуре сыворотки крови больных сифилисом в присутствии комплемента.
Реакцию выполняют в меланжерах. Основной опыт – соединение в смесителе сыворотки больного, взвеси тканевых спирохет
и активного комплемента.
Положительный -выше 50, слабоположительный – от 31 до 50, сомнительный – от 21 до 30, отрицательный – ниже 30.

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ
ПИФ
Выполняется на предметном стекле, учитывается с использованием люминесцентного микроскопа.
На стекло наносится изучаемый материал с неизвестным антигеном, фиксируется жидким фиксатором, после чего на препарат наносят специфическую иммунную сыворотку, меченную флюорохромом. Стекло инкубируют, промывают проточной водой. В случае совпадения антигена и специфической сыворотки на стекле образуется комплекс АГ-АТ, при микроскопии под ультрафиолетовыми лучами наблюдается свечение изучаемого объекта.
НИФ
В данной модификации с помощью известного антигена проводят поиск специфических антител в биологическом материале. В практике широко распространена РИФ для диагностики сифилиса.

МЕТОД РАДИОИММУННОГО АНАЛИЗА
В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) – маркирование
радионуклидом антигена или антител, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счетчиках импульсов.

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Метод иммуноферментного анализа использует коммерческие реагенты – АГ или АТ, маркированные ферментами.
В отличие от классических методов выявления ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия.
Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.
1. В лунки полистиролового планшета вносят сыворотку крови пациентов.
2. Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут.
3. Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз.
4. Вносим во все лунки антисыворотку с АТ против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом.
5. Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз.
6. Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин.
При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет – он становится желтым. В отрицательном контроле цвет не меняется.