Лаб диагностика аллергопатологии

Иммунология вместе со всей ее диагностикой
и всей ее терапией является сегодня самой популярной и самой скандальной областью медицины

Особенности иммунопатологий
«Молодость» и быстрое развитие иммунологии – изменение диагностической значимости маркеров и «гуляющая» норма
Нарушения в иммунной системе долгое время не сопровождаются субъективными ощущениями у больного - Позднее обращение к врачу
Первичный дефект в иммунной системе приводит к поли-
органной патологии
Иммунопатология проявляется через нарушение функции различных органов и систем – пациент попадает к «слабо-
подготовленному» врачу-специалисту: отсюда загадочные диагнозы и неадекватная терапия

Органы иммунной системы

Lymphocyte Subsets
B LYMPHOCYTE
T LYMPHOCYTES

Представление антигена
Индуктивная фаза
Эффекторная стадия
Динамика иммунного ответа

Представление антигена – антиген захватывается макрофагами и переваривается
Макрофаг активируется и выделяет ИЛ-1, который стимулирует Т-хелперы
Динамика иммунного ответа

Т-хелперы, получив 2 сигнала от макрофагов выделяют ИЛ-2, который стимулирует пролиферацию Т-и В-лимфоцитов
Динамика иммунного ответа

В-лимфоциты превращаются в плазматические клетки, которые синтезируют антитела
Т-хелперы стимулируют Т-супрессоры, которые тормозят иммунный ответ
Образуются клетки иммунологической памяти
Динамика иммунного ответа

Immune System
Cell-mediated immunity
Humoral immunity
Stem-Cells
Progenitor B-cell
Progenitor T-cell
Mature inducible T-cell
Mature inducible B-cell
AG
Macrophage
AG-Presentation
Interleukines
Interleukines
T-helper Cell
T-suppressor cell
T-killer cell
B-memory cell
Plasma cell
B-cell activation
T-cell stimulation
Lymphokines
Suppression
Suppression
Stimulation
antibodies
AG
AG-depended
Иммунная
система

Виды иммунопатологий
ИММУНОАГРЕССИЯ
ИММУНОДЕПРЕССИЯ
ДИСБАЛАНС
Первичные ИД
Вторичные ИД
Иммунокомпроменти-
рованные состояния
Аллергия (ГНТ)
Аутоиммунные заболевания (АИЗ)
Лимфопролиферативные
заболевания (ЛПЗ)

Иммунодиагностика и иммунотерапия:
«простая» логика
ПАЦИЕНТ
ИММУНОДИАГНОСТИКА
подтверждающий диагноз
ИММУНОСТИМУЛЯТОР
КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА
ИММУНОДИАГНОСТИКА
контроль лечения
ИММУНОПАТОЛОГИЯ?

Аллергия
Специфическая повышенная чувствительность к антигенам (аллергенам) в результате неадекватной реакции иммунной системы
Гиперчувствительность, обусловленная иммунными механизмами

Распространенность аллергических заболеваний
Западная Европа 25 - 30%
Отдельные экологически
неблагоприятные регионы 50 - 60%
Промышленные районы России 15 - 35%
Заболеваемость среди детей
в крупных промышленных городах 10 - 40%

Распространенность аллергических заболеваний
Аллергические риниты 10 - 15%
Атопический дерматит 10%
Аллергическая крапивница 10%
Аллергическая астма 5 - 10%
Аллергия на пищевые продукты 2%

Распространённость аллергических
заболеваний в России
Частота аллергических заболеваний в России составляет от 10 до 30%
Более 14% населения страдают сезонным аллергическим ринитом
У 10-20% населения в течение жизни встречается 1 случай крапивницы
Среди многообразия форм крапивницы, идиопатическая составляет 80-95%

Структура аллергических
заболеваний
На 1-ом месте аллергический ринит; при отсутствии адекватного лечения трансформируется в БА
Бронхиальная астма
Аллергические дерматиты (АД)
Среди АД на 1-ом месте крапивница, причём до 80% составляет идиопатическая, т.е. неуточнённой этиологии

Аллергены — вещества, вызывающие
аллергические заболевания

Реакции гиперчувствительности
(по Gell P., Coombs R. 1969)

Реакции гиперчувствительности

Реакции гиперчувствительности по А.Д. Адо

I тип – немедленного типа

I I тип – цитотоксический
(копмлемент-зависимый цитолиз)

III тип – иммунокомплексный
с участием коплемента

IV тип – гиперчувствительность замедленного типа ( >12 часов)

Классификация гиперчувствительности
по определению Комиссии номенклатурного комитета EAACI 2001 г

Специфическая дегрануляция базофила/тучной клетки
Аллерген
Сенсибилизация
Образование IgE-антител
Связывание IgE-антител с FcεRI тучных клеток и базофилов
ФосфолипазаС
Протеинкиназа С, ↑ Ca2+
Разрушение комплекса актин-миозин
Дегрануляция

Неспецифическая дегрануляция базофилов/тучных клеток
Ca2+
C3a, C5a
Лекарства
Физические факторы
Дегрануляция

Продукты, выделяемые базофилами/тучными клетками при дегрануляции
Немедленно: гистамин, серотонины, гепарин, хондроитинсульфат, фактор активации тромбоцитов
В течение 10-45 минут: лейкотриены, простагландин D2, тромбоксан А2
В течение 2-12 часов: ИЛ3, 4, 5, 6, 13, ГМ-КСФ, хемокины

Клинические проявления аллергии

Восприятие пациента…

Классификация побочного действия лекарств (1959 г.)
Передозировка – абсолютная при увеличении дозы; относительная – при нарушении функции печени, почек; кумуляционная
Непереносимость – нежелательные побочные эффекты препарата, усиленные у данного больного
Идиосинкразия – не отожествлять с аллергией – необычные реакции на впервые в жизни вводимые препараты, бывает при ферментопатиях
Аллергические реакции, в которых лекарство выполняет роль аллергена — лекарственная аллергия

Современная классификация побочного действия лекарств
1. Токсические реакции
Передозировка
Токсические реакции от терапевтических доз, связанные с замедлением метаболизма лекарств
Токсические реакции в связи с функциональной недостаточностью печени, почек
Отдаленные токсические эффекты (тератогенность, канцерогенность)
2. Суперинфекции и дисбактериозы
3. Реакции, связанные с массивным бактериолизом под действием лекарства (реакция Яриша-Герсгей-мера и др.)
4. Реакции,обусловленные особой чувствительностью субпопуляции
Необычные реакции, отличные от фармакологических, обусловленные, вероятно, энзимопатиями
5. Псевдо­аллергические реакции
6. Аллергические реакции
7. Психогенные реакции
8. Лекарственные эмболии

Лекарственная аллергия (ЛА)
•
Это специфическая иммунная реакция на лекарственные препараты, сопровождающаяся общими или местными клиническими проявлениями
ЛА развивается только при повторном введении препарата
На впервые в жизни вводимый препарат ЛА не развивается

Факторы риска
• рост потребления лекарственных препаратов населением;
• широкое распространение самолечения вследствие доступности лекарств (возможности приобретения их без рецептов);
• недостаточность или запаздывание медицинской информации о побочных действиях лекарственных средств;
• полипрагмазия и политерапия;
• загрязнение окружающей среды промышленными отходами;
• заболевания инфекционного, паразитарного, вирусного или другого характера, сами по себе не являющиеся аллергическими, но в силу особенностей патогенеза создающие возможность формирования сенсибилизации и выработки аллергических антител в ответ на самые различные аллергены, в том числе и лекарственные (в частности, часто возникают аллергические реакции на пенициллин у больных микозами стоп);

Факторы риска
• • применение для лечения и откорма птицы, скота антибиотиков, витаминов и других препаратов, создающих возможность сенсибилизации населения за счет примесей, содержащихся в пищевых продуктах (мясо, молоко), полученных от этих животных;
• наследственная, генетически обусловленная предрасположенность;
• наличие других видов аллергии (бактериальной, пыльцевой, пищевой и др.);
• применение депо-препаратов (например, бициллин), продукты метаболизма которых могут усиливать аллергенное действие друг друга;
• физико-химическая структура, высокая сенсибилизирующая активность препарата.

Особенности лекарственных осложнений аллергического характера
Не напоминают фармакологического действия препарата
Возникают от минимальной дозы вводимого препарата
Никогда не развиваются на впервые в жизни вводимый препарат
Исключение составляет скрытая сенсибилизация к пенициллину. Остальными препаратами надо лечится, чтобы развилась аллергическая реакция
Лекарственная аллергия всегда имеет объективные проявления – кожный зуд, бронхоспазм, ринит и т. д.

Особенности лекарственных осложнений аллергического характера
Аллергические реакции при последующем введении препарата не только повторяются, но и утяжеляются
Аллергические реакции на лекарства не зависят от путей введения препарата
В отличие от истинных аллергических реакций при псевдоаллергических отсутствуют антитела и иммунные Т-лимфоциты
Течение лекарственной аллергии труднопредсказуемо и определяется как свойствами препарата, так и состоянием организма

При аллергической реакции начало всегда с кожного зуда и высыпаний и только позднее поднимается температура, воспаляются лимфоузлы и т.д.
При инфекции наоборот – начало с температуры, затем сыпь
Кожные высыпания легко переходят в пиодермию
Хроническое течение
Особенности лекарственных осложнений аллергического характера

Отличия аллергических реакций от псевдоаллергических

Отличия аллергических реакций от псевдоаллергических

Отличия аллергических реакций от псевдоаллергических

Диагностическими критериями ЛА служат следующие признаки
Установление связи клинических проявлений с приемом лекарства
Смягчение или исчезновение симптомов после отмены
Отягощенный по аллергии личный и семейный анамнез
Хорошая переносимость препарата в прошлом

Диагностическими критериями ЛА служат следующие признаки
Исключение других видов побочного действия (токсического, фармакологического, и пр.)
Наличие латентного периода сенсибилизации — не менее 7 дней
Сходство клинических симптомов с проявлениями аллергии, но не с другим эффектом
Положительные аллергологические и иммунологические тесты

Лекарственная аллергия
1. Антибиотики
Пенициллин
Бициллин
Стрептомицин
2. П/столбнячная сыворотка (часто у атопиков с зпидермальной сенсибилизацией)
3. Ароматические амины
Сульфаниламиды
Новокаин
Дикаин
Гипотиазид
Аминазин
4. Аспирин и препараты пиразолонового ряда
Баралгин
5. Витамины (группы В)
6. Гормоны (инсулин, АКТГ)
7. Препараты йода

Лекарственная аллергия
Общие детерминанты имеются у пенициллина и цефалоспоринов
Новокаин, сульфаниламиды и ПАСК — также имеют близкие антигенные свойства
Йод и все препараты его содержащие (раствор Люголя, йодконтрастные препараты)
Пиразолоновые препараты, ацетилсалициловая кислота и фенилпропионаты (бруфен)
Левомицетин и синтомицин, особенно при его местном применении
Кокарбоксилаза и витамин В1
Супрастин и эуфиллин
Аминазин и пипольфен
Стрептомицин и аминогликозиды (гентамицин, мономицин, канамицин)

Анафилактический шок — тяжелое, угрожающее жизни патологическое состояние, развивающееся при контакте с некоторыми антигенами-аллергенами у сенсибилизированного человека

Анафилактический шок - острая тяжелая системная угрожающая жизни реакция гиперчувствительности, сопровождающаяся выраженными нарушениями гемодинамики (согласно международным рекомендациям (WAO): снижение систолического артериального давления ниже 90 мм рт. ст. или на 30% от исходного уровня), приводящими к недостаточности кровообращения и гипоксии во всех жизненно важных органах
Код МКБ-10: Т78.0 Анафилактический шок, вызванный патологической реакцией на пищу; Т78.2 - Анафилактический шок, неуточненный; Т80.5 - Анафилактический шок, связанный с введением сыворотки; Т88.6 - Анафилактический шок, обусловленный патологической реакцией на адекватно назначенное и правильно примененное лекарственное средство

Анафилактический шок вид аллергической реакции немедленного типа,
возникающей при повторном введении в организм аллергена
Анафилактический шок характеризуется быстро развивающимися преимущественно общими проявлениями: снижением АД, температуры тела, свертываемости крови,
расстройством ЦНС, повышением проницаемости сосудов и спазмом
гладкомышечных органов

Причины анафилактического шока(АШ)
Лекарственная аллергия
Аллергия к ужалению насекомых
Пищевые аллергены
Холодовой АШ
При лечении аллергенами

Группы риска
Наличие наследственной предрасположенности
Аллергическая конституция у больного
Хронические очаги инфекции Полипрагмазия, эффект суммации лекарств

Патогенез АШ
3 стадии
Иммунологическая
Патохимическая
Патофизиологическая

Варианты течения анафилактического шока
Типичный
Гемодинамический
Абдоминальный
Церебральный
Асфиктический

Причины смерти от АШ
Смерть на высоте коллапса
Смерть от асфиксии
Смерть от отёка мозга

Лекарственная аллергия - диагностика
Сбор аллергологического анамнеза
Кожные тесты
Провокационные тесты
ТТЕМЛ по А.Д. Адо
Лабораторные методы

К кожным пробам надо относится критически
Многие лекарства обладают местораздражающим действием и дают на коже ложноположительные реакции
Кожные пробы, поставленные пациенту, сенсибилизированному к данному препарату, могут спровоцировать анафилактический шок. Поэтому кожные пробы потенциально опасны
Помнить, что аллергия формируется в процессе лечения, а пробу мы ставим до начала лечения и она может быть отрицательной. Поэтому отрицательная кожная проба не исключает вероятность ЛА

К кожным пробам надо относится критически
Если больной ранее не получал данное лекарство, то и кожные пробы с ним проводить не надо
Кожные пробы совпадают только у 30% пациентов и то у аллергиков
У детей раннего возраста, иногда у пожилых людей при ЛА - кожные пробы отрицательны

В настоящее время разрешённым тестом для диагностики ЛА является тест торможения естественной миграции лейкоцитов по А.Д. Адо.
Это прямой провокационный тест – при поступлении в организм аллергена происходит торможение миграции лейкоцитов

Противопоказания для ТТЕМЛ по А.Д.Адо
Наличие острых заболеваний
Заболевания полости рта (кариес, пародонтоз) – результаты могут быть ложноположительными
Постоянный длительный приём стероидов
Отсутствие зубов
У маленьких детей, которые не могут выполнить требования врача
Пробы не ставятся с пролонгированными препаратами

Диагностика гиперчувствительности немедленного типа
Псевдоаллергия

Кожное тестирование – основной метод специфической аллергодиагностики
Аллерген воздействует на клетки кожи • Prick (укольный) тест
• Скарификационные пробы
• Внутрикожные пробы
• Patch (аппликационный) тест

• Учёт реакции через 15 минут по отношению к (+) и (–) контролям.
• Самый специфичный из всех кожных тестов.
Укольный тест – “золотой
стандарт” аллергодиагностики

Внутрикожная проба

Аппликационный path-тест
• Для выявления аллергических реакций замедленного типа на контактные аллергены
• Учёт реакции через 48 и
72 часа
• Для диагностики пищевой аллергии при атопическом дерматите у детей
- Положительная проба ассоциируется
с поздней фазой клинической
реакции, наблюдаемой при пищевом
провокационном тесте

Провокационные пробы
• Конъюктивальный тест
• Эндоназальный тест
• Ингаляционный тест
• Пищевой провокационный тест
Аллерген воздействует на клетки
шокового органа

• Аллерген в виде пудры, с хорошей назальной абсорбционной способностью, стандартизован и дозы оттитрованы в AU
• Капсулы содержат порошок аллергена в 2-х дозировках и плацебо, пригодны для распыления с помощью ингалятора
Назальный провокационный тест

• Тест двойного- слепого плацебо контролируемого провокационного исследования - "золотой стандарт" диагностики пищевой аллергии
• Желатиновые капсулы содержат 10-кратно увеличивающиеся дозы высушенного пищевого продукта и плацебо
Пищевой провокационный тест

Профилактика АШ
Избегать полипрагмазии
Назначение ЛС строго по показаниям
Наблюдение за пациентом в течение не менее 30 минут после введения ЛС
Просветительская работа среди пациентов об опасности самолечения
Чего нельзя делать
Нельзя назначать лекарственное средство, ставшее причиной развития анафилактического шока, комбинированные средства, его содержащие, перекрестно-реагирующие препараты
Нельзя употреблять пищевой продукт, вызвавший развитие АШ
Нельзя использовать лекарственные средства, содержащие пыльцу растений у больных с подтвержденной сенсибилизацией к пыльцевым аллергенам
Нельзя начинать лечение АШ с введения антигистаминных препаратов

Лабораторные
методы диагностики

Алгоритм аллергодиагностики
Анамнез,
Лабораторные методы
Определение IgE и Ig G антител
Определение катионного белка эозинофилов (ЕСР)
Клеточные тесты

Преимущества использования тестов in vitro
- Нет противопоказаний к обследованию
- Не вызывают дополнительной сенсибилизации, нет риска анафилактических реакций
- Нет возрастных ограничений, возможно проводить в самом раннем возрасте
- Большое число тестируемых аллергенов, выявление поливалентной сенсибилизации
- Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на расстоянии)

Показания к определению общего IgE
Первичная диагностика атопии
Первичная и вторичная профилактика аллергии
При первичных иммунодефицитных состояниях
При IgE-миеломе
Вспомогательный метод диагностики гельминтозов

Показания к определению специфического IgE
Уточнение причинно-значимого аллергена во всех случаях, особенно при сомнительных результатах кожного тестирования
Дифференциальная диагностика аллергических и неаллергических (псевдоаллергических) заболеваний
Выявление скрытой (субклинической) сенсибилизации – обнаружение высоких уровней специфических IgE-антител при отсутствии клинических проявлений свидетельствует о повышенном риске возникновения аллергических реакций на данные аллергены

Показания к определению специфического IgE
Мониторинг концентрации IgE при проведении специфической иммунотерапии Затруднение или невозможность проведения тестов in vivo:
ранний детский возраст
пациенты с высокой степенью сенсибилизации
обострение основного заболевания
декомпенсированные состояния болезней сердца, печени, почек и системы крови

Показания к определению специфического IgE
период после острой аллергической реакции
невозможность отмены антигистаминных, гормональных и других препаратов
измененная реактивность кожи
исследование с большим количеством аллергенов одновременно

Ложноположительные результаты
• Ложноположительные результаты могу быть из-за перекрёстного реагирования аллергенов

Перекрестно-реагирующие аллергены

Перекрестно-реагирующие аллергены

Клеточные тесты
Тесты выявляют повышенную чувствительность клеток-мишеней к воздействию аллергена

IgE-зависимая дегрануляция и высвобождение медиаторов аллергии
Немедленное высвобождение
Содержимое гранул:
Гистамин, TNF-α,
Протеазы, Гепарин
Через несколько
минут
Лейкотриены,
Простагландины
Через несколько часов
Продукция цитокинов
IL-4, IL-13, IL-5,
FcεRI
FcεRI
связывающий сайт
Привлечение клеток
Аллергическое
воспаление

Базофильные тесты
• Реакция дегрануляции базофилов
• Базофил активирующий тест • Тесты высвобождения медиаторов: гистамина, лейкотриенов
Визуальный подсчет процента дегранулированных клеток после инкубации с аллергеном относительно контроля по окраске толлуидиновым синим.
Цитометрическое определение процента дегранулированных клеток после инкубации их с аллергеном по экспрессии СD63 или CD203с.
Количественное или процентное определение высвободившихся медиаторов из клеток после инкубации их с аллергеном.
- выявляют немедленную реакцию клеток

CAST (Cellular Antigen Stimulation Test)
Технология CAST (Cellular Antigen Stimulation Test), тест антигенной стимуляции клеток) основана на определении сульфидолейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4), секретируемых примированными IL-3 базофилами под действием аллергенов in vitro. Его также называют провокационным тестом in vitro. Метод патентован, авторы - проф. De Weck и д-р Sainte-Laudy. Благодаря синтезу сульфидо-лейкотриенов (sLT) de novo анализ CAST® обладает высочайшей специфичностью по сравнению с классическим тестом высвобождения гистамина
Протокол исследования включает три этапа: выделение популяции лимфоцитов из стабилизированной ЭДТА крови, стимуляция лимфоцитарной суспензии специфическими аллергенами и иммуноферментный анализ синтезированных базофилами во время стимуляции лейкотриенов
Тест высоко чувствителен и специфичен, особенно при лекарственной гиперчувствительности

Диагностика иммуноагрессий
АЛЛЕРГИЯ
АИЗ
ЛПЗ
Cпецифические IgE
Активация базофилов in vitro
Медиаторы аллергии (Hs, ФЛА2 – эйкозаноиды, др.)
Органоспецифические аутоантитела
ОрганоНЕспецифические аутоантитела
Маркеры иммунного воспаления (ЦИК, СРБ, др.)
Факторы предрасположенности – HLA
Количественно-морфологические характеристики
Линейно-ассоциированные маркеры
Дифференцировочные маркеры

Проточная цитофлуориметрия
Исследование клеток или частиц в потоке по параметрам светорассеяния и флуоресценции
переднее и
боковое
светорассеяние,
флуоресценция
Лазер
Исследование малых популяций клеток

Исследование активации базофилов
Аллерген
Регистрация активации базофилов
Костимулирующие факторы
Растворимые продукты
ELISA
Поверхностные маркеры
Проточная цитофлуориметрия
Технология
CAST:
Cellular
Antigen
Stimulation
Test

Тест активации базофилов
Исследование активации/дегрануляции базофилов с помощью проточной цитофлуориметрии
Исследование маркеров активации/дегрануляции
CD45, CD11b, CD11c, CD63, CD203c, CD13, CD164, CD107a
СD63 – классический маркер дегрануляции
СD203с – специфический маркер активации базофилов

Тест активации базофилов
Исследование активации/дегрануляции базофилов с помощью проточной цитофлуориметрии
Базофилы 0,84%
Дегранулировавшие базофилы

Тест активации базофилов
Исследование активации/дегрануляции базофилов с помощью проточной цитофлуориметрии
Базофилы 1,4%
Активированные
базофилы

Выбор маркера:
CD63 или CD203c?
CD203c – более специфичный для базофилов маркер
CD63 – более исследованный
В отношении разных аллергенов – разная значимость маркеров
Специфичность – 95-100%, Чувствительность 85-98%
Тест активации базофилов
Исследование активации/дегрануляции базофилов с помощью проточной цитофлуориметрии

Достоинства
Хорошая альтернатива провокационным тестам
Единственный тест для дифференциальной диагностики псевдо- и истинной аллергии (особенно в отношении лекарственных средств)
Недостатки
Функциональный тест – значимость преаналитической стадии
Отсутствие стандартов
Небольшой опыт применения, разногласия в значимости маркеров
Тесты активации базофилов и антигенной стимуляции клеток – достоинства и недостатки

Тесты функциональной активности лейкоцитов при действии аллергенов
• Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ )
• Тесты высвобождения интерлейкинов
Подсчёт процента подавления миграции лейкоцитов крови при инкубации их с аллергеном относительно контроля по определению длины пробега лейкоцитов в капиллярах.
Количественное определение продукции IL-4, IL-5, IL-13 при инкубации лейкоцитарной взвеси крови с аллергеном.
- выявляют позднюю фазу реакции клеток

Уже сегодня диагностический потенциал для оценки нарушений в иммунной системе является поистине безграничным. Однако остаются вопросы: «кто будет определять, что нужно исследовать у конкретного пациента», «кто будет интерпретировать результаты» и «кто за это будет платить»