Методика проточной цитометрии и клеточной сортировки, их применение

Флуоресценция

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции
Spectra Viewer

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции
Spectra Viewer

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции
BD FLUORESCENCE SPECTRUM VIEWER A MULTICOLOR TOOL

Клеточный сортер Beckman MoFLO XDP
Особенности прибора:
Скорость анализа – до 100’000 событий в секунду
Скорость сортировки – до 70’000 клеток в секунду
5 лазеров, 16 ФЭУ для регистрации флуоресценции

Технические характеристики:
Твердотельные лазеры с длинами волн 407, 488, 561, 592, 628 нм
14 каналов ФЭУ с фильтрами в диапазоне длин волн от 430 до 820 нм
Возможность термостатирования образца и собранных популяций клеток
Возможность одновременной сортировки до 4-х популяций
Скорость сортировки до 70000 клеток в секунду
Анализ сортировки до 100000 событий в секунду
Множество режимов сортировки от обогащения популяции до высокоэффективной сортировки без примесей других клеток.

Клеточный сортер состоит из нескольких блоков:
Лазеры
Оптическая система, обеспечивающая подведение лазерного излучения к клеткам
Оптическая система, собирающая флуоресценцию
Система светофильтров и ФЭУ, детектирующая флуоресценцию
Система подачи обжимающей жидкости и образца
Все это есть у проточных цитофлуориметров.
Для сортировки клеток необходимы:
Пьезокристалл, разбивающий струю на капли
Система подачи заряда на капли
Анод и катод, пролетая между которыми клетки отклоняются и попадают в одну из нескольких пробирок
Вычислительный блок, координирующий работу прибора
Устройство клеточного сортера
Beckman Coulter Inc: MoFlo XDP high-speed cell sorter: Instructions for use. 2010. 239.

Комплектация лазеров:
488 нм Flow-Check, Flow-Check Pro
407 нм Flow-Check Pro
628 нм
561 нм Rainbow Fluorescent Particles
592 нм

Beckman Coulter Inc: MoFlo XDP high-speed cell sorter: Instructions for use. 2010. 75.
Пример устройства оптических систем

Комплектация каналов:

Система гидрофокусировки
Диаметр наконечника (nozzle): 70, 100, 150, 200 мкм.
Необходимость системы гидрофокусировки: обеспечение положения клеток ровно в центре струи, что дает постоянное пятно контакта лазера с клеткой, что необходимо для точности регистрации флуоресценции.
Beckman Coulter Inc: MoFlo XDP high-speed cell sorter: Instructions for use. 2010. 84.

Настройка подведения лазерного излучения к клеткам обеспечивается с помощью микровинтов
Beckman Coulter Inc: MoFlo XDP high-speed cell sorter: Instructions for use. 2010. 93.

Выбор “отрывающейся” капли
Регистрация флуоресценции – клетка в струе,
Сортировка клеток – клетка в капле
Beckman Coulter Inc: MoFlo XDP high-speed cell sorter: Instructions for use. 2010. 239.

Подготовка прибора к сортировке:
Разогрев лазеров – 10 минут
Настройка струи – до 5 минут (во время разогрева лазеров)
Настройка синего (488 нм) лазера – до 5 минут
Настройка остальных пар лазеров – до 5 минут
Настройка Drop delay time – до 10 минут (Flow-Check, Drop delay calibration particles)

CD3 – T лимфоциты
CD3 CD4 – T хелперы
СD3 CD8 – T киллеры
PE/Cy5 (Ex – 488 nm, Em – 670 nm)
PE (Ex – 488 nm, Em – 578 nm)
Выявление T-хелперов с помощью проточной цитометрии

Выделение и характеристика химиорезистентных клеток боковой популяции низкодифференцированной глиомы C6
Мультиформная глиобластома – одна из самых злокачественных нейроэпителиальных опухолей головного мозга.
Средняя продолжительность жизни после
постановки диагноза составляет 15 месяцев.
Существующие методы терапии малоэффективны.
Причина – наличие субпопуляций
химиорезистентных клеток.
Трудоемки в изучении, немногочисленны.
Необходимо обогащение субпопуляций.

Факторы, способствующие химио- и радиорезистентности глиобластомы
Гипоксия, более эффективная репарация поврежденной ДНК, наличие определенных микро РНК, отсутствие таргетных онкопротеинов, микроокружение
Присутствие ABC транспортеров
Ген ABCB1 ? P-gp ? препятствует проникновению ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ в цитоплазму клетки
Ткани мозга:
В норме: ABCB1 (P-gp), ABCA2, ряд других ABC белков, имеющихся в большинстве тканей.
При онкологии: увеличение экспрессии генов ABCB1, ABCG2 белков и генов других ABC белков.
ABC транспортеры как фактор химиорезистентности глиобластомы

Blue fluorescence
Химиорезистентные клетки боковой популяции
Флуоресцентные красители:
Hoechst 33342
Dye Cycle Violet

Спектры возбуждения красителей
Dye Cycle Violet и Hoechst 33342
Спектр флуоресценции красителя
Dye Cycle Violet
Спектры флуоресценции красителя
Hoechst 33342
Точечная диаграмма, построенная в каналах регистрации флуоресценции красителя Dye Cycle Violet

Оптимизация расположения каналов для получения максимального сигнала

Точеные диаграммы, позволяющие определить процент клеток боковой популяции
SP = (1,12 ± 0,14)%.

Условия сортировки
Диаметр ноззла – 70 мкм
Давление – 60 psi
Разница давлений образца и обжимающей жидкости – 0,5 psi
Частота 92500 Гц
Амплитуда 15.5 В
IntelliSort – включен
Концентрация клеток – 5*10^6/ 1 мл
Объем образца – 2 мл
Количество отсортированных клеток – 1* 10^5
Режимы сортировки – Enrich (для клеток SP), Purify (для клеток nonSP)
Напряжение на синем канале FL6 – 450 В, напряжение на красном канале Fl7 – 670 В
Температура пробирки во время сортировки – +4С

Определение процента клеток боковой популяции в отсортированных образцах после первого пассажа
SP=(31,59 ± 1,25)%,
SP= (0,77 ± 0,10)%

Динамика изменения процента клеток боковой популяции в образцах после сортировки

Схема эксперимента по изучению цитотоксичности цисплатина
График зависимости доли погибших клеток от концентрации цисплатина для обогащенной и необогащенной культуры клеток

Сортировка GFP+ клеток 4T1 карциномы молочной железы

IVIS Spectrum Pre-clinical In Vivo Imaging System

МикроКТ и 3D-оптическая томография
Снимки мыши с ортопической карциномой 4T1-Luc2 на 35 сутки после имплантации
МОДЕЛИРОВАНИЕ И КОМПЛЕКСНАЯ РЕНТГЕНОВСКАЯ, ОПТИЧЕСКАЯ И МРТ-ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПОЛИОРГАННЫХ МЕТАСТАЗОВ ОРТОТОПИЧЕСКОЙ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 4Т1 У МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/c.

Сортировка B220+ CD5+ лимфоцитов
488 нм
488 нм
561 нм

Изучение процессов переноса красителя C-AM из клеток DiL+ C-AM+ в DiL- C-AM- клетки