Применение методов молекулярной биологии в исследовании

ИНДИКАЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ Vibrio cholerae В ПЦР

Подготовка пробы
Выделение ДНК
Амплификация ДНК (ПЦР)
Регистрация результатов
ЭТАПЫ ДИАГНОСТИКИ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР

Исследуемый материал:
клинический материал
- испражнения (нативные или 1% п.в.)
- рвотные массы (нативные или 1% п.в.)
- мазок содержимого прямой кишки (в 1% п.в.)
объекты окружающей среды
- вода поверхностных водоемов объем пробы - 1 литр
- сточные воды концентрирование пробы:
- центрифугированием
- фильтрацией
- смывы с поверхностей (берут стерильным зондом, помещают в 1,5 мл. пробирку с 0,5 мл. 1 % п.в.)
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

I-я и II-я пептонная вода
центрифугирование в течение 10 мин. при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 300 мкл физ. раствора.
микробная взвесь 106-107 м.к./мл
18-ч. культура 109 м.к./мл 108м.к./мл 107 м.к./мл
V.cholerae на ЩА на физ. р-ре на dН2О на dН2О
ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ПРОБ
добавление мертиолята натрия до конечной концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при 56 0С 30 мин.

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК
Применение стандартных наборов для
выделения ДНК (по протоколу)
Изготовители: - РосНИПЧИ «Микроб»
- ДНК-Технология
- Интерлабсервис (ДНК-сорб, Рибо-
преп)

АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК (ПЦР)
ферментативная циклическая реакция синтеза in vitro относительно коротких (от нескольких десятков до нескольких тысяч п.о.) двухцепочечных фрагментов ДНК на ДНК-матрице

СТАДИИ ПЦР

Выявление ДНК V. cholerae в ПЦР с электрофоретическим учетом реакции

1000 н.п
564 н.п.
300 н.п.
1. V.cholerae eltor И-449 (б-ой)
2. V.cholerae eltor И-1321 (вода)
3. V.cholerae eltor И-1355 (вода)
4. V.cholerae eltor И-1283 (вода)
5. V.cholerae eltor И-1263 (б-ой)
6. V.cholerae eltor И-1298 (б-ой)
7. V.cholerae eltor И-1345 (б-ой)
8. Дистил. вода (- контр.)
9. V.cholerae eltor М-878 (+ контр.)
10. Маркер молекулярного веса
1, 5-7 пробы - ctxA+ культуры эпидемически опасные
2- 4 пробы - ctx A- культуры эпидемически неопасные
Тест-система для выявления V.cholerae ctxA+ (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов)

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ (ГЕН VIBRIO CHOLERAE - ИДЕНТИФИКАЦИЯ – РЭФ)
Рег. уд. № ФСР 2012/13430 - 210512
ТУ 9398-039-01898109-2011
(РосНИПЧИ «Микроб», Саратов)
определение эпидемической значимости:
фрагмены генов ctxA (569 п.н.) tcpA (218 п.н.)
определение принадлежности к О1 серогруппе биовара Эльтор: фрагменты генов wbeN (420 п.н.) и hlyAeltor/не-О1 (264 п.н.)
определение принадлежности к О139 серогруппе
фрагмент гена wbfR (439 п.н.)
ПЦР-смесь-«ctx-tcp»,
ПЦР-смесь-«О1-биовар»
ПЦР-смесь-«О139»

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE O1 КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬТОР БИОВАРОВ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭЛЬТОР ВИБРИОНОВ НА ТИПИЧНЫЕ И ИЗМЕНЕННЫЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ
(ГЕН VIBRIO CHOLERAE ВАРИАНТ CTXB–РЭФ)
Рег. уд. № ФСР 2012/13427 - 210512
ТУ 9398-032-01898109-2011
(РосНИПЧИ «Микроб», Саратов)
Типичные токсигенные штаммы V. cholerae О1 классического биовара фрагменты генов wbO1 (кодирует биосинтез О1-антигена), cas3 (хеликаза CRISPR/CAS-системы), ctxBClass (аллель гена ctxB классического типа).
Типичные токсигенные штаммы V. cholerae О1 Эль Тор вибрионов фрагменты генов wbO1, rtxC (кластер rtx генов, кодирующих биосинтез RTX-токсина), ctxBEltor (аллель гена ctxB Эль Тор типа).
Измененные варианты Эль Тор вибрионов наряду с генами wbO1 и rtxC характерно наличие ампликона ctxBClass.

Выявление ДНК V.cholerae в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени (real-time PCR)

ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (real-time PCR) (ДИНАМИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ
ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ В ПРОЦЕССЕ ПЦР)
)
Сигнал флюоресценции пропорционален количеству молекул ДНК

Молекулярные маяки
(molecular beacons)

ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ
флуоресцентных методов детекции результатов ПЦР
Высокая чувствительность
Специфичность (гибридизационные методы)
Возможность количественного анализа
Упрощение аналитического процесса
Скорость
Уменьшение вероятности контаминации
Стандартная интерпретация результатов
Стоимость (флюорофоры, зонды)
Высокая чувствительность (контаминация, исходное количество материала)
Дополнительное оборудование

Индикация, идентификация и определение эпидемической значимости V. cholerae в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени
СУЩНОСТЬ МЕТОДА
В реакционную смесь
добавляют ДНК-зонды
с флуоресцентной меткой
в 5’ и гасителем
флуоресценции в 3’
положении. Зонды имеют
места посадки внутри
амплифицируемой области.

Предназначен для:
- выявления ДНК V. cholerae (по наличию
последовательности гена hly)
идентификации патогенных штаммов V. cholerae (по
наличию основных факторов патогенности – ctxA, tcpA)
- определение принадлежности к серогруппе О1 (по наличию амплификации мишени wbeT) или к серогруппе О139 (по наличию амплификации мишени wbfR).
НАБОР РЕАГЕНТОВ
для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией
«АмплиСенс Vibrio cholerae-FL»

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ В МУЛЬТИПЛЕКСНОМ ФОРМАТЕ В ДВУХ ПРОБИРКАХ:
Пробирка «Скрин» - амплификация мишеней
ctxA (FAM/Green)
tcpA (ROX/Orange)
внутреннего контрольного образца (JOE/Yellow/HEX)
Пробирка «Тип» - амплификация мишеней
wbeT (FAM/Green )
wbeF (ROX/Orange)
hly (JOE/Yellow/HEX )

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учет результатов – на основании пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (указывается
пороговый цикл - Ct)

Определение генов, отвечающих за синтез О1 и О139 антигенов

Определение биоварспецифичных маркеров
методом ПЦР

Определение эпидемической значимости холерных вибрионов на основании выявления ctxA и tcpA генов методом ПЦР

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ (выяснение источников, путей и факторов распространения холерного вибриона, установления эволюционных взаимосвязей между штаммами):
- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
- PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) - метод электрофореза в пульсирующем поле
- Ribotyping – Ириботипирование
- AFLP (ampliphycation fragment lengh polymorphism) - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов
- RAPD (random amplified polymorphic DNA) - произвольно амплифицированная полиморфная ДНК
- MLVA (Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis) -мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов
- MLST (Multilocus sequence typing) - мультилокусное сиквенс-типирование
- секвенирование отдельных участков генома
- SNP-трипирование (Single nucleotide polymorphism)
- WGS whole genome sequencing

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ:
- NotI 5'...G C^G G C C G C...3'
3'...C G C C G G^C G...5'
- SfiI 5'...G G C C N N N N^N G G C C...3'
3'...C C G G N^N N N N C C G G...5'
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

Изучение структуры генов рибосомальной РНК (16S и 23S рРНК)
Эндонуклеазы рестрикции:
- HindIII 5'...A^A G C T T...3'
3'...T T C G A^A...5'
- BglI 5'...G C C N N N N^N G G C...3'
3'...C G G N^N N N N C C G...5'
RIBOTYPING

Электрофорез в 8% ПААГ продуктов амплификации локуса VcA штаммов V. cholerae eltor О1
MULTIPLE-LOCUS VARIABLE NUMBER TANDEM REPEAT ANALYSIS (MLVA)

Типирование на основе секвенирования генов
«домашнего хозяйства» (housekeeping gene)
MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST)