53, 54 Дифтерия и туберкулез

МИКРОБИОЛОГИЯ ДИФТЕРИИ
Дифтерия — это острая, антропонозная, воздушно-капельная, токсинемическая инфекция, которая характеризуется развитием воспалительных изменений слизистых оболочек ротоглотки и верхних дыхательных путей, сопровождающихся образованием плотно спаянных с подлежащими тканями фибринозных пленок, на фоне симптомов специфической интоксикации макроорганизма.
Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterim, виду С. diphtheriae.
Морфологические — тонкие, слегка изогнутые или прямые грамположительные палочки. Утолщены на концах за счет наличия зерен волютина на одном или обоих полюсах клетки, что придает им вид булавы или булавки.
Дифтерийная палочка неподвижна, спор и капсул не образует; имеет микрокапсулу. Клеточная стенка у C. diphtheriae содержит вещества пептидополисахаридной природы, в состав которых входят галактоза, манноза, арабиноза. Как и микобактерии, содержат в составе клеточной стенки большое количество липидов, в том числе некислотоустойчивые корииеформные миколовые кислоты.

Культуральные и биохимические свойства. Возбудитель дифтерии относится к факультативным анаэробам. Гетеротроф. Для выделения С. diphtheriae из патологического материала применяется свернутая кровяная сыворотка как таковая (элективная среда Ру) или с добавлением сахарного бульона (элективная среда Ру—Леффлсра), а также кровяной агар, кровяной теллуритовый агар (среда Клауберга II), хинозольная среда Бучина. На теллуритовых средах С. diphtheriae растут в виде черных или черно-серых колоний в результате восстановления теллурита до металлического теллура, который накапливается внутри бактерий в виде кристаллов.
Другим важным дифференциально-диагностическим признаком является способность С. diphtheriae продуцировать фермент цистиназу (проба Пизу). Вид С. diphtheriae подразделяют на 4 биовара: gravis, mitis, intermedius и belfanti.

Рост культуры на среде Клауберга и результаты микроскопии мазка из колоний

Таблица по фенотипической дифференцировке коринебактерий

Результаты фенотипических тестов
Тест Пизу
Уреазный тест
Мальтоза
Сахароза

Модифицированный Elek-тест
Среда для определения токсигенности 10 мл+СКРС 2мл
Стерильная полоска фильтровальной бумаги 0,7×8см, смоченная 0,125мл разведенного до 500МЕ/мл антитоксина
Контрольный (токсигенный) штамм
Опытные культуры C.diphtheriae
(из одного анализа по три бляшки – две из отдельных колоний и одну из смеси нескольких)
Посеянные бляшками
d 6-7мм
7-8мм
5мм
Линии преципитации у бляшек токсигенных культур
Розлив среды→нанесение полоски с антитоксином →подсушивание дном вверх 15мин 37°С →посев культур →инкубация 37°С →учет через 18-24 и 48ч

Результаты фенотипических тестов
Рост в питательном бульоне
Тест на гемолиз
Расщепление крахмала
https://fips.edrid.ru/images/rid/56/08/de/33d93689cfcdcfcc9ebd0be4d88094ed.jpg
Elek тест
1 – tox+контроль
2,3,4 – исследуемая культура

Антигенная структура. С. diphtheriae по антигенной структуре не однородны. Их серологическая неоднородность обусловлена поверхностными термолабильными серовароспецифическими К-антигенами (белками). Видовыми и межвидовыми термостабильными липидными и полисахаридными фракциями О-антигенов, расположенных в глубине клеточной стенки.
Факторы патогенности. Основными факторами патогенности возбудителей дифтерии являются:
1.поверхностные структуры липидной и белковой природы, к которым относится корд-фактор,
2. коринеформная миколовая кислота, входящий в состав микрокапсулы, 3.ферменты и токсины, ферменты агрессии и инвазии, нейраминидазу и N-ацетилнейрамиатлизу, гиалуронидазу, а также гемолизин и дермонекротоксин.
С. diphtheriae делятся на токсигенные и нетоксигенные штаммы. Заболевание вызывают только токсигенные штаммы С. diphtheriae. Способностиь токсинообразованию проявляют штаммы С. diphtheriae, содержащие профаг в своем геноме, несущий tох-ген ответственный за синтез токсина.
Устойчивость в окружающей среде. С. diphtheriae обладают значительной устойчивостью к воздействию факторов окружающей среды. Выживаемость их на предметах окружающей среды может достигать 5,5 месяцев и не сопровождаться утратой или снижением вирулентности.

Эпидемиология. Дифтерия относится к антропонозным заболеваниям. Источником инфекции при дифтерии являются больные и носители токсигенных штаммов. Больной эпидемиологически опасен в течение всего периода заболевания.
В соответствии с основной локализацией возбудителя в верхних дыхательных путях, аэрозольный механизм заражения является основным.
Ведущая роль принадлежит воздушно-капельному пути передачи инфекции, при котором микробы выделяются в окружающую среду больным или носи гелем токсигенных штаммов С. diphtheriae при разговоре, кашле или чихании.
Возбудитель передается инфицированными через предметы общего пользования (полотенца, игрушки, носовые платки) руками..
Этиопатогенез. Входными воротами инфекции служат слизистые оболочки ротоглотки, носа, гортани, трахеи, слизистые оболочки глаз и половых органов, поврежденные кожные покровы, раневая или ожоговая поверхность. Дифтерия относится к токсинемическим инфекциям, при которых микроб остается в месте входных ворот инфекции, все основные клинические проявления заболевания связаны с действием бактериального токсина.
Начальным этапом инфекционного процесса является адгезия микроба в месте входных ворот инфекции за счет поверхностных структур бактериальной клетки (корд-фактор и коринеформные миколовые кислоты) и их колонизация. Размножаясь в месте вводных ворот инфекции, C.diphtheriae образует дифтерийный гистотоксин, который оказывает местное воздействие на клетки тканей, поступает в кровь, что ведёт к возникновению токсинемии.
В области входных ворот инфекции развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся некрозом эпителиальных клеток, отеком и выходом фибриногена из сосудистого русла в окружающие ткани и превращением его в фибрин под действием тромбокиназы, освободившейся при некрозе эпителиальных клеток.
Это ведет к образованию налетов белого цвета с сероватым или желтоватым оттенком, содержащих большое количество микробов, продуцирующих токсин. Фибринозная пленка - характерный признак дифтерии. Фибринозное воспаление при дифтерии может быть дифтерическим или крупозным.

Дифтерическое воспаление возникает на слизистых оболочках с многослойным плоским эпителием (ротоглотка, надгортанник, голосовые связки, некоторые отделы полости носа), все клетки которого прочно связаны как между собой так и с подлежащей соединительнотканной основой. В таком случае фибринозная плёнка плотна спаяна. С подлежащей тканью и не снимается тампоном при осмотре.
Крупозное воспаление возникает при локализации патологического процесса в дыхательных путях (гортань, трахея и бронхи), где слизистые оболочки содержат железы, выделяющие слизь и покрытые однослойным, цилиндрическим эпителием. Пленка легко отделяется от подлежащих тканей.
Особенности иммунитета. После перенесенного заболевания формируется длительный и напряженный гуморальный антитоксический иммунитет.
Микробиологическая диагностика дифтерии.
Бактериологический метод диагностики с определением токсигенности коринобактерий.
Материалом для исследования служат слизь, пленки из очагов воспаления, мокрота, а также секрет из очагов патологического процесса.

Результаты микроскопии мазка из фибринозной пленки (окраска по методу Грама)
https://microbe-canvas.com/uploads/image/bacterien/corynebacterium-diphtheriae/corynebacterium-diphteriae_cor48_cult_gram-3_f-350x220.jpg

Профилактика и лечение. Дифтерия - токсинемическая инфекция. В целях нейтрализации дифтерийного гистотоксина проводят лечение антитоксической противодифтерийной сывороткой. Одновременно с введением антитоксической противодифтерийной сыворотки больным необходимо обязательно назначать антибиотики, оказывающие действие на эти бактерии.
Специфическая профилактика дифтерии
- адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС-вакцина),
- адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС-анатоксин),
-адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М-анатоксин),

Иммунопрепараты

МИКРОБИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА
Туберкулез – бугорчатка, чахотка - хроническая инфекционное заболевание, характеризующееся образованием в различных органах, чаще в лёгких, специфических воспалительных изменениях. Возбудители туберкулеза относится к семейству Mycobacteriaceae, туберкулез вызывает комплекс M. tuberculosis (вариант M.microti, M. canettii – непатогенны для человека), M bovis, M africanum
По морфологии это тонкие, прямые или слегка изогнуты. Большинство липидов представлено миколовыми кислотами, которые не только фиксированы в каркасе клеточной стенки, но и присутствуют в виде свободных гликопептидов - и корд - факторов. Высокое содержание липидов в клеточной стенке придаёт этим бактериям ряд характерных свойств - устойчивость к кислотам, щелочам и спирту. Для окраски микобактерий используют метод Циля- Нильсона.

2.Культуральные свойства. Требовательны к питательным средам: для роста необходимы глицерин и аминокислоты. Используются яично-глицериновая среда Левинштейна-Иенсена; картофельная глицериновая среда. Микобактерии туберкулеза. растут очень медленно. Видимый рост на твёрдых питательных средах появляется на 21-28 день, в жидких на 7-10 день, для появления обильного роста необходимо 4-6 нед.
На плотных средах бактерии дают морщинистые, сухие, с неровными краями, изолированные, не сливающиеся друг с другом колонии. При культивировании на жидких средах - рост на поверхности в виде сухой пасты, которая со временем уплотняется, становится бугристо-морщинистой.

Результаты микроскопии мазка из мокроты (окраска по Цилю-Нильсену)
http://upulmanologa.ru/wp-content/uploads/2017/11/okraska-materiala-po-tsilyu-nilsenu-krasnym-tsveto.png

Рост культуры на среде Левенштейна-Йенсена
24 день

Для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты:
Ниациновый тест. К водному экстракту агаровой культуры микобактерий добавляют полоску, пропитанную реактивами (20%ПАСК, 60% роданистым калием и 50% хлорамином В). Появление желтого окрашивания экстракта у дна пробирки через 15-30 минут свидетельствует о положительном результате.
Тест на наличие нитратредуктазы. Суспензию микобактерий в течение 3 часов инкубируют с буферным раствором нитрата натрия. Затем последовательно добавляют реактивы: разведенную 1:1 соляную кислоту, 0,2% раствор сульфаниламида, 0,1% раствор N-нафтилэтилендиамина. Красное окрашивание свидетельствует о положительном результате.
Тест на наличие термостабильной каталазы. После прогревания суспензии бактерий при 68˚С в течение 2 часов микобактерии, не имеющие термостабильной каталазы, не расщепляют перекись водорода.
Тест на наличие способности расти на среде с салициловокислым натрием (1мг/мл). Микобактерии комплекса M. tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на их рост угнетающее действие. Микобактерии комплекса не дают роста на среде с салициловокислым натрием.
Для дифференциации M. tuberculosis и M. bovis следует учитывать результаты следующих проб:
Тест на наличие пиразинамидазы. Этот тест основан на способности M. tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. Тест применяется для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis не проявляет пирамидазной активности.
Рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2карбоксиловой кислоты (ТСН). Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислоты (ТСН) используется для дифференциации M. bovis и M. tuberculosis и других медленнорастущих микобактерий. Только M. bovis чувствительны к низким концентрациям ТСН (от 1 до 5 мкг/мл) M. tuberculosis и другие микобактерии устойчивы к действию этого соединения.

Таблица по фенотипической дифференцировке микобактерий

Результаты фенотипических тестов
Ниациновый тест
Нитратредуктазный тест
Пиразинамидазный тест
https://himedialabs.ru/tub

Результаты фенотипических тестов
I-III – посевы на разные концентрации ТСН
IV – незасеянный контроль

Антигенные свойства. В АГ структуре микобактерий выделяют 4-е гр. АГ:
- общие для всех,
- общие для медленно растущих,
-общие для быстрорастущих, общие для определенного вида.
Возбудители имеют сложное АГ строение. АГ микобактерий. являются белки и фосфолипиды клеточной стенки, Корд-фактор и эндотоксин-туберкулим.
Факторы-вирулентности: токсический компонент клеточной стенки - жирные кислоты: миколовая, фтионовая и др.; эндотоксин и корт-фактор.

Этиопатогенез - источник инфекций - больной человек (бациллярный больной), выделяющий с мокротой микобактерии.
Для возбуждения конфликта с хозяином, бактерии должны попасть в альвеолы, где микобактерии поглощаются резидентными макрофагами, отношения с которыми определяют дальнейшее развитие событий. Неслучайно ТВС относится к классическим внутримакрофагальным инфекциям - TBC”- болезнь макрофагов. Взаимодействие между палочками и макрофагами инициируют базисный для ТВС процесс воспаления - гранулематозного типа. Неспецифическая гранулема трансформируется в специфическую, обретая признаки, характерные для ТВС. Именно с этого момента гранулема называется туберкулом.
По эпидемиологической опасности:
-открытую и закрытую формы.
При открытой форме в мокроте обнаруживаются микобактерии и больной представляет опасность для окружающих. При закрытой микобактерий в мокроте нет, больной опасности для окружающих не представляет.
Для выявления состояния инфекционной аллергии ставят диаскин тест.

Выделяют 2 патогенетических варианта туберкулёза: первичный и вторичный. Первичный – возникает у лиц ранее не имевших контакт с возбудителем. Инфицирование обычно происходит в раннем детском возрасте, развивается без аллергии к возбудителю. В зоне внедрения возбудитель захватывается микрофагами, возбуждая неспецифическую гранулематозную реакцию. Бактерии легко проходят этот барьер, быстро проникают в регионарные лимфатические узлы.
Развитие истинного туберкулёза (т.е. специфической гранулемы) занимает 2-3 недели – формируется первичный аффект, а втягивание в процесс регионарной лимфоидной ткани ведёт развитию лимфаденита и лимфангита, т.е. формируется первичный ТВС комплекс. Первичный очаг поражения в лёгких со временем может инкапсулироваться и кальцинироваться с образованием петpификата – очаг Гона. Этот процесс не завершается полным освобождением организма от возбудителя и микобактерии могут сохраняться в организме на протяжении многих лет, создавая состояния инфицированности. Запомните! бактерионосительства при ТВС – нет.
Вторичный ТВС-развивается в более позднем возрасте при эндогенной инфекции или повторном инфицировании. С мокротой возбудитель попадает в гортань, ротовую полость, кишечник, кровяное русло, угрожая экстрапульмонарными осложнениями. Интоксикация – одно из обязательных проявлений ТВС.

Лабораторная диагностика ТВС
1. бактериоскопический - окраска мазков по методу Циля – Нильсона.
2. люминисцентныя микроскопия – носит ориентировачный характер, т.к. не позволяет отличить возбудителя ТВС от других микобактерий.
3. стандартом является бакериологический метод.
4. биологический метод - используется только если трудно выделить возбудителя при бакисследовании - чаще при ТВС почек.
5. метод микрокультур Прайса - в качестве ускоренного метода .
6. в последнее время применяют молекулярно-генетические методы - ПЦР и ДНК зондирование для обнаружения генов М.tub. в исследуемом материале.
7. используют аллергический метод – постановка кожно-алергической пробы Манту с туберкулином, выявление состояния инфекционной аллергии.

Материал для выделения культуральным методом, обнаружения антигенов и нуклеиновых кислот микобактерий зависит от очага поражения:
Мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж, биоптаты, экссудаты, моча, спинно-мозговая жидкость и др.

Микроскопический метод
Иммерсионная микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по методу Циля-Нильсена или флуоресцентными красителями. Позволяет выявить возбудителя, когда в 1 мл мокроты содержится не менее 5000-10 000 МБТ, и при условии, если просмотрены 300 полей зрения. Люминесцентный метод на 10-15% чувствительнее обычной световой микроскопии.

Бактериологическое исследование с обязательным определением чувствительности к противотуберкулезным препаратам (ПТП); чувствительный метод; отношение выделенных культур к микобактериям туберкулеза определяется с помощью ИХА или генетических методов, условно патогенным микобактериям - с помощью генетических методов и масс-спектрометрии
Определение устойчивости к ПТП:
Фенотипические -метод абсолютных концентраций, метод пропорций
Генотипические - биологические микрочипы, ДНК-стрипы, набор GeneXpert MTB/RIF, мультиплексная ПЦР в режиме реального времени
https://www.mediastorehouse.com/p/173/biochip-detection-tuberculosis-6333593.jpg
http://www.nanometer.ru/2009/10/11/rosnauka_157475/PROP_IMG_images_7/IMG_4565.JPG

Фенотипическая дифференцировка M.tuberculosis и медленно растущих условно патогенных микобактерий
*есть единичные исключения

Молекулярно-генетические методы: используются отдельно и сочетаются с бактериологическим исследованием для определения лекарственной устойчивости и идентификации нетуберкулезных микобактерий
ПЦР Real time и другие методы с определением генов устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам

Иммунодиагностика: серологическая диагностика (ИФА); иммуноиндикация - обнаружение липоарабиноманнана микобактерий в клиническом образце, чаще моче пациента, методом ИФА, ИХА.
LAM присутствует и у нетуберкулезных микобактерий
https://www.researchgate.net/publication/224853336/figure/fig3/AS:216461181231118@1428619775365/Photograph-of-a-Determine-TB-LAM-test-strip-showing-the-sample-pad-to-which-60-mL-of-the.png
ИХА LAM-тест

Аллергические методы: внутрикожные тесты -диаскин-тест с рекомбинантным белком CFP10-ESAT6, методы ИФА для оценки сенсибилизации CD4-клеток к антигенам микобактерий туберкулеза, проба Манту с туберкулином
IGRA-методы (Interferon-Gamma Release Assays): реакция Т-лимфоцитов на специфические белки МБТ - ESAT-6 и CFP10 (гены, кодирующие эти белки, отсутствуют в геноме Mycobacterium bovis BCG и большинстве нетуберкулезных микобактерий). Основаны на ИФА:
квантифероновый тест (детекция количества освобожденного интерферона-γ Т-лимфоцитами).
«T-SPOT-TB» (детекция самих активированных лейкоцитов не только в венозной крови, но и в экссудатах и СМЖ).
Для забора крови пациента (квантифероновый тест – нулевая пробирка, пробирка с АГ МБТ и пробирка с митогеном
https://slideplayer.com/slide/10241318/34/images/28/T-Spot.TB%3A+Six+easy+Steps.jpg
Результаты T-SPOT-TB

Профилактика ТВС. Живой аттенуированной вакциной БЦЖ, содержащий авирулентный штамм М.boris. Проводят на 3-7нед. Ревакцинации в 5-7лет и более поздние сроки. Ревакцинацию проводят БЖЦ вакциной.
Особенности иммунитета: нестерильный; неустойчивый, клеточный.