Блокаторы периферического анионного сайта ацетилхолинэстеразы на основе пиримидина в качестве средства симптоматической терапии

Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера – наиболее часто встречающееся нейродегенеративное заболевание у лиц пожилого возраста. Общепринятой гипотезой развития болезни Альцгеймера является «амилоидная гипотеза», согласно которой главной причиной запуска каскада нейродегенеративного процесса является нарушение метаболизма белка-предшественника амилоида. Ключевым звеном в этом каскаде является гиперпродукция токсического бета-амилоидного пептида, который приводит к образованию амилоидных бляшек и гибели нейронов головного мозга.

Болезнь Альцгеймера
Все существующие подходы лечения относятся к симптоматической терапии. Наиболее эффективные подходы основаны на попытках компенсации холинергического дефицита. Однако, существуют предпосылки считать, что ингибиторы фермента ацетилхолинэстеразы способны оказывать влияние на патогенез заболевания, уменьшая агрегацию бета-амилоидного пептида.

Цель работы:
Исследовать эффективность соединений-лидеров, синтезированных в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова ФИЦ КазНЦ РАН, в отношении терапии симптомов болезни Альцгеймера.
Задачи работы:
Изучить способность исследуемых соединений ингибировать ацетил- и бутирилхолинэстеразу в условиях in vitro;
Исследовать острую токсичность выбранных соединений;
Исследовать эффективность симптоматической терапии болезни Альцгеймера в условиях фармакологической и генетической моделей данного заболевания на мышах и крысах,
Исследовать влияния соединений на количество амилоидных депозитов в коре головного мозга животных с болезнью Альцгеймера;

Проверка острой токсичности
Поведенческие тесты ( Т-тест, УРПИ )
Оценка острой токсичности соединений проводилась согласно «Методическим рекомендациями по изучению общетоксического действия лекарственных средств».
Исследование способности соединений восстанавливать нарушения памяти в условиях модели болезни Альцгеймера изучали при помощи теста в Т-лабиринте, основанного на обучении животных вознаграждаемому чередованию, а также на основании скорости выработки рефлекса условно-пассивного избегания (УРПИ).
Материалы и методы

Моделирование Болезни Альцгеймера
Фармакологическая модель болезни Альцгеймера – основана на создании холинергического дефицита в результате инъекции лабораторным животным препарата скополамина.
Генетическая модель болезни Альцгеймера – воспроизводит мутацию гена предшественника амилоидного пептида, которая у человека в 100 % случаев приводит к развитию болезни Альцгеймера.

Приготовление срезов головного мозга и окрашивание амилоидных депозитов флуоресцентным красителем
Криостат Microm HM 525
Конфокальный сканирующий микроскоп LEICA DM 6000 CFS
Окрашивание амилоидных бляшек проводили согласно методике Майера, используя флуоресцентный краситель амилоидных отложений Тиофлавин S.

Результаты исследования
Ингибиторная активность соединений

Антихолинэстеразная активность и токсичность соединения №117

Средний процент выбора правильного направления и процент обучившихся животных в тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях фармакологической модели на мышах (С76)
*-различие с контролем статистически достоверно при p≤0.05.
(Сравнение выполнено по Манн-Уитни)

Средний процент выбора правильного направления и процент обучившихся животных в тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях генетической модели на мышах (С76)
*-различие с контролем статистически достоверно при p≤0.05.
(Сравнение выполнено по Манн-Уитни)

Средний процент выбора правильного направления и процент обучившихся животныхв тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях фармакологической модели на мышах (С82)
*-различие с контролем статистически достоверно при p≤0.05.
(Сравнение выполнено по Манн-Уитни)

Средний процент выбора правильного направления и процент обучившихся животных в тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях генетической модели на мышах (С82)
*-различие с контролем статистически достоверно при p≤0.05.
(Сравнение выполнено по Манн-Уитни)

Средний процент выбора правильного направления в тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях фармакологической модели на мышах (С117)
Средний процент выбора правильного направления в тесте
«вознаграждаемое чередование» в Т-образном лабиринте в условиях генетической модели на мышах (С117)

Количество амилоидных бляшек в коре головного мозга мышей
(в поле зрения, увеличение х 10)
Контроль (Tg+)
Донепезил (Tg+)
Соединение №117 (Tg+)

Средний латентный период захода в затемненный отсек в
поведенческом тесте УРПИ на скополаминовой модели БА (117)
*-различие с контролем статистически достоверно при p≤0.05.
(Сравнение выполнено по Манн-Уитни)

Выводы
1. Исследуемые соединения с лабораторными С76, С82 и С117 показали способность угнетать активность АХЭ в наномолярном диапазоне концентраций, в то время как, активность БуХЭ угнетается данными соединениями миллимолярном диапазоне концентраций;
2. Соединения обладают низкой по сравнению с используемыми в клинике антихолинэстеразными препаратами токсичностью.
3. С76 в дозе 5 мг/кг при внутрибрюшинном способе введения купирует симптомы нарушения пространственной памяти в условиях скополаминовой модели БА, однако на генетической модели БА данное соединение оказалось не эффективно.
4. С82 показало свою эффективность как в условиях фармакологической, так и генетической модели БА в дозе 10 мг/кг.
5. С117 в дозах 1 и 10 мг/кг восстанавливает нарушения пространственной памяти у трансгенных мышей с БА, достоверно уменьшая количество бета-амилоидных отложений в головном мозге.
6. При использовании дозы в 10 мг/кг С117 показало способность восстанавливать нарушения пространственной памяти в условиях фармакологической модели БА на крысах в тесте УРПИ.

Исследования были поддержаны грантами РНФ 14-50-00014 и РНФ 19-15-00344. Подана заявка на поддержку доклинических испытаний в рамках ФЦП «Фарма 2020».
Результаты исследования были доложены на 3-ей Российской конференции по медицинской химии (Казань, 28 сентября – 3 октября 2017) и X Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз 2017» (Казань, 25 – 28 октября 2017).