Критические компоненты и параметры ПЦР
ОБЩАЯ СХЕМА ПЦР Принцип метода ПЦР заключается в следующем: в реакционную смесь вносят мДНК, дАТФ, дСТФ, дГТФ, дТТФ, ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и два синтетических олигодезоксинуклеотидных праймера, фланкирующих исследуемый фрагмент мДНК. Реакционную смесь разогревают до температуры ~95оС , что приводит к расхождению цепей ДНК. Это дает возможность для «отжига» праймеров при температуре от 37оС до 65оС, с этого момента праймеры могут служить затравкой для работы ДНК-полимеразы. Температуру реакционной смеси поднимают до оптимальной температуры работы фермента и проводят элонгацию цепей вновь синтезирующейся ДНК в течение 0,5-2 минут. По окончанию стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР и начинается второй, третий и последующие циклы в автоматическом режиме. I II III IV КРИТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики данного метода важны для исследователя: Специфичность реакции – продуктом ПЦР должен быть именно тот локус ДНК, который амплифицировали, других продуктов от ПЦР быть не должно (при этом не обращают внимание на ошибочно включенные, в результате работы полимеразы, нуклеотиды); Точность синтеза ДНК – ошибки в амплификафии недопустимы при определении первичной структуры аплифицированного локуса, или при использвоании продукта ПЦР для синтеза кодируемого им белка в генно-инженерных системах экпресии; Эффективность синтеза ДНК – количественно оценивается по выходу продукта после окончании реакции. Теоретически через n циклов количество продуктов ПРЦ достигнет 2n-1 штук с каждой молекулы кДНК. Однако на практике такое происходит редко.
Slaidy.com
