Воздействие нейропептидов семакс и PGP на содержание транскриптов гена в головном мозге крыс в условиях экспериментальной ишемии

ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНСУЛЬТ
Ишемический инсульт является повреждающим фактором, нарушающим функционирование мозга и заметно влияющим на экспрессию генов в головном мозге. Нарушения при ишемическом инсульте провоцируются резким ухудшением мозгового кровотока, влекущим за собой:
1. кислородную и глюкозную недостаточность,
2. как следствие (1) – нарушение протекания ОВР в клетке и падение уровня АТФ,
3. как следствие (2) – нарушение работы ионных каналов,
4. изменение внутриклеточной среды,
5. изменения на уровне повреждённых тканей,
6. гибель нейронов.
Поиск новых подходов для лечения ишемии остаётся актуальной проблемой.

Глутамат-кальциевый каскад
Ключевой механизм развития ишемического повреждения – глутамат-кальциевый каскад, в ходе которого нарушается функционирование ионных каналов, происходит массивный приток Na+ и Ca2+ в клетку, а из клетки высвобождаются возбуждающие аминокислоты, в первую очередь глутаминовая. Под её влиянием ионы кальция, продолжая прибывать извне, высвобождаются и из внутриклеточных депо. Это, во-первых, усиливает экзоцитоз, в том числе глутамата, а во-вторых, активирует (через связывание кальция с кальмодулином) гидролитические ферменты, разрушающие компоненты клетки.

КОМПЛЕКСИНЫ
Комплексины относятся к числу цитозольных белков, специфичных для нервной ткани и регулирующих процесс экзоцитоза путём взаимодействия с белковым комплексом SNARE, обеспечивающим высвобождение синаптических пузырьков в синаптическую щель. В связи с этим комплексины интересны как возможные участники процессов глутамат-кальциевого каскада.

Альтернативные транскрипты гена Cplx2
У крыс обнаружено два варианта транскриптов гена Cplx2 – Cplx2_v1 и Cplx2_v2, различающиеся 5’-концевыми участками (ген имеет альтернативные промоторы). Ген Cplx2 человека также имеет два варианта транскриптов, обладающих высоким сходством с соответствующими транскриптами крыс. Факторы, определяющие транскрипцию по тому или иному пути, до конца не выяснены.
Рис. Структурная
организация гена
Cplx2 человека

СЕМАКС И PGP
Семакс – нейропротекторный препарат, относящийся к числу регуляторных пептидов (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro). N-конец пептида содержит модифицированный фрагмент АКТГ (4-7), а C-конец содержит мотив Pro-Gly-Pro (PGP), задерживающий процесс деградации семакса. Также трипептид PGP обладает самостоятельным регуляторным действием.

Цели и задачи исследования
С целью исследования изменения экспрессии гена Cplx2 поставлены следующие задачи:
Проанализировать качество препаратов тотальной РНК, выделенных из мозга экспериментальных животных, синтезировать на их основе препараты кДНК.
При помощи метода ОТ-ПЦР оценить изменение относительного содержания альтернативных транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры и в подкорковых структурах головного мозга крыс в результате дейсвия фокальной ишемии, а также введения семакса и PGP.

Схема эксперимента

Схема участков головного мозга крыс, в которых исследовали изменение транскрипции после необратимой окклюзии левой средней мозговой артерии.
IC - лобно-теменная доля коры ипсилатерального полушария мозга;
CC - лобно-теменная доля коры контралатерального полушария мозга;
IS - подкорковые структуры ипсилатерального полушария мозга;
CS - подкорковые структуры контралатерального полушария мозга

Проверка качества препаратов тотальной РНК
<- 28S
<- 18S
<- 5S
Электрофореграмма препаратов суммарной РНК лобно-теменной доли коры крыс.
28S, 18S, 5S – субъединицы рибосомной РНК.

Подбор праймеров

Real-time PCR (Sybr Green I)
Подбор праймеров,
Подбор условий для проведения ПЦР в реальном времени (концентрация кДНК, температурный профиль реакции),
3. Определение эффективности PCR и оценка уровня относительной экспрессии с помощью программы REST (relative expression software tool),
4. Обработка полученных данных с использованием программы REST.

Динамика изменений относительного содержания мРНК гена Cplx2 у крыс, подвергнутых фокальной ишемии

Динамика изменений относительного содержания мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга крыс с фокальной ишемией, вызванных применением семакса и PGP

Динамика изменений относительного содержания мРНК гена Cplx2 в подкорке головного мозга крыс с фокальной ишемией, вызванных применением семакса и PGP

Выводы
1. Подготовлена панель образцов кДНК для анализа экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии головного мозга крыс и воздействия пептидов семакс и PGP.
2. Под воздействием ишемии относительное содержание транскриптов гена Cplx2 в коре головного мозга спустя сутки после окклюзии снижается в 2 раза. При этом влияния ишемии на содержание мРНК гена Cplx2 в подкорковых структурах не обнаружено.
3. В условиях фокальной ишемии оба исследуемых пептида вызывают снижение содержания мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга крыс спустя 72 часа после окклюзии. Эффект PGP оказывается более выраженным, чем эффект семакса. Влияния препаратов в подкорке не наблюдается.
4. Не обнаружено различий в характере изменений экспрессии альтернативных транскриптов гена Cplx2 в условиях эксперимента.